手把手教学｜单碱基编辑技术原理及实验操作指南（下）：细胞转染、编辑效率检测、注意事项

哺乳动物细胞中可能的碱基编辑结果：初始编辑导致 U:G 错配。尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 对 U 的识别和切除启动碱基切除修复 (BER)，从而导致恢复到 C:G 起始状态。BE2 和 BE3 会阻碍 BER，从而抑制 UDG。U:G 错配也由错配修复 (MMR) 处理，错配修复优先修复错配的缺口链。BE 3 缺口包含 G 的未编辑链，有利于将 U:G 错配解决为所需的 U:A 或 T:A 结果。 图片来 源：doi: 10.1038/nature17946。

上期链接： 手把手教学｜单碱基编辑技术原理及实验操作指南（上）：技术原理、靶点设计与sgRNA合成

实验步骤（接上）

3.2 细胞转染

3.2.1 细胞培养前处理

1. 培养基配置（以HEK293T为例）：

• DMEM高糖培养基 + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素
• 细胞传代：当汇合度达80-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3min

2. 铺板参数：

• 6孔板：2×10^5 cells/孔（转染前24h铺板）
• 培养条件：37℃, 5% CO2, 湿度>90%

3.2.2 转染复合物制备（脂质体法）

1. 试剂配制（以Lipofectamine 3000为例）：

• Tube A（DNA混合液）：

• Tube B（脂质体混合液）：

2. 孵育条件：

• 将Tube A和Tube B分别涡旋5s
• 将Tube B缓慢加入Tube A，轻柔吹打混匀
• 室温静置15min（形成DNA-脂质体复合物）

3.2.3 转染

1. 吸除细胞培养基，加入1.5 mL新鲜培养基（不含抗生素）

2. 将250 μL转染复合物逐滴加入孔板，十字摇匀

3. 6h后更换为完全培养基（含抗生素）

4. 转染24h后：加入嘌呤霉素（终浓度1-2 μg/mL）

5. 每日观察细胞状态：

• 正常：细胞贴壁良好，增殖减缓但无大面积死亡
• 异常：若24h内细胞死亡率>90%，需降低筛选浓度

6. 筛选72h后：更换为正常培养基

3.2.4 终止培养与细胞收集

1. 转染后72小时（完成嘌呤霉素筛选），弃去培养基

2. 加入1×PBS（预冷至4℃）轻柔洗涤细胞2次（每次2 mL/孔，6孔板）

3. 加入0.25%胰蛋白酶-EDTA（含酚红）1 mL/孔，37℃孵育2-3分钟

4. 显微镜下确认细胞脱离后，加入2 mL完全培养基终止消化

5. 将细胞悬液转移至1.5 mL离心管，1000 rpm离心5分钟

6. 弃上清，细胞沉淀用200 μL PBS重悬备用

3.3 编辑效率检测

3.3.1 PCR扩增

1. 取适量细胞沉淀，使用试剂盒提取基因组DNA（如 QuickExtract DNA Extraction Solution（Epicentre） ）

2. 引物设计： 引物距离编辑位点至少50 bp（避免引物二聚体干扰）

示例引物：

Forward: 5'-CCTGTACCACAGCCTTAAGG-3'

Reverse: 5'-GTAGTCGGTGTCGGCTGATA-3'

3. 配制PCR反应体系（25 μL体系）：

4. 扩增程序：

• 预变性：95℃ 3min
• 35个循环：95℃ 30s → 60℃ 30s → 72℃ 45s
• 终延伸：72℃ 5min

3.3.2 T7E1酶切分析

1. 异源双链制备：

• 混合PCR产物（200 ng）与等量野生型DNA
• 95℃变性5min → 每分钟降温2℃至25℃

2. 酶切反应：

• 反应体系：

• 37℃孵育30分钟 → 加入6×Loading Buffer终止反应

3. 电泳分析： 2%琼脂糖凝胶，120 V电泳30分钟

切割条带比例估算公式：

3.3.3 Sa nger测序定量

1. PCR产物送测序，使用EditR（https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/）分析峰图

2. 计算公式：编辑效率=突变峰高度/(野生峰高度+突变峰高度)×100%

4 注意事项

4.1 sgRNA合成失败排查

• 无连接产物：检查BsmBI酶切效率（电泳确认载体线性化）

• 测序不匹配：重新设计引物避免回文结构

4.2 转染效率提升

低效处理：

• 增加DNA总量至3 μg/孔（需保持BE:sgRNA=3:1）

• 改用PEI转染（jetOPTIMUS®，Polyplus-transfection）

细胞毒性处理：

• 若转染后24小时细胞圆缩率>30%，降低脂质体用量20%

4.3 多靶点共转染

• 需控制总DNA量≤4 μg/孔

• 不同sgRNA质粒需使用不同抗性筛选标记（如sgRNA1用puromycin，sgRNA2用hygromycin）

5 参考资料

1. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420-424.