在肺癌的综合治疗中，化疗占有重要的地位，尽管新的化疗药物不断问世，化疗方案日趋完善，但肿瘤细胞的多药耐药性（multidrugresistance，MDR）严重限制化学药物的治疗效果。铂类药物是肺癌联合化疗方案中的核心部分，其中顺铂是对目前肺癌患者单制剂及联合用药化疗效率最高的药物之一，探讨顺铂的多药耐药对于肺癌化疗具有相当大的指导意义。多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）作为介导多药耐药的近端机制蛋白，在肺癌MDR研究中占据非常重要的地位。
消岩汤应用于肺癌的临床治疗已有10余年，临床疗效确切，对肺癌化疗具有增效减毒的作用[1-2]，由生黄芪、太子参、郁金、姜黄、白花蛇舌草、夏枯草、生牡蛎等组成，方中生黄芪、太子参益气健脾、补肺养阴，郁金、姜黄活血化瘀，白花蛇舌草、夏枯草等清热解毒，诸药相伍，共奏扶正解毒祛瘀之功。本研究从国内外肺癌研究的关注热点和难点——化疗耐药入手，采用Western blotting免疫印迹法及RT-PCR技术，探索具有扶正解毒祛瘀作用的中药复方消岩汤对肺癌耐药模型的耐药逆转作用机制。通过检测消岩汤含药血清对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞MRP1、LRP蛋白及其mRNA表达的影响，以期发现消岩汤逆转化疗耐药的作用靶点，寻找临床疗效可靠且副作用小的化疗耐药逆转剂，为攻克肺癌化疗多药耐药奠定一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1 药品
消岩汤（太子参、生黄芪、白花蛇舌草、蜂房等共计140 g）水煎液，规格100 mL/瓶，由天津中医药大学第一附属医院制剂室提供。消岩汤水煎液由天津中医药大学中药提取室严格按回流提取法进行提取，最终浓缩成为质量浓度相当于生药材1.5 g/mL的药液[3]，冷却装入灭菌药瓶，置4 ℃冰箱备用。
1.2 动物
SPF级健康BalB/C雄性裸鼠，80只，4～6周龄，体质量18～20 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK-（军）2014-0004。
1.3 细胞
人肺腺癌A549细胞由天津医科大学基础实验中心提供；耐顺铂（DDP）肺腺癌A549/DDP细胞购自上海博谷生物科技有限公司和天津柳叶峰医药技术开发有限公司。
1.4 试剂与仪器
RPMI 1640培养基、新生胎牛血清（Hyclone公司）；All-in-OneTM First-Strand cDNASynthesis Kit 反转录试剂盒（Gene Copoeia公司）；Mini-Protean 3 电泳系统、Mini Trans-Blot Module电泳转印芯、PowerPac Basic Power Supply基础电泳仪（Bio-Rad公司）；Epgiadients PCR仪（Eppendorf公司）；ABI7500 fast荧光定量PCR仪（Life Technologies公司）；FluorChem FC2成像分析系统、AlphaView系统软件（Alpha Innotech公司）。
1.5 细胞培养
细胞复苏、传代与培养参照文献报道方法[4]。复苏后的人肺腺癌A549、A549/DDP细胞，分别接种于50 mL培养瓶，加入RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL）6 mL，置于37 ℃、饱和湿度、含5%CO2的孵箱中无菌培养，A549/DDP细胞则在2μg/mL DDP的RPMI 1640培养基中诱导培养，实验前2 d，更换成无DDP的培养基培养。
1.6 A549裸鼠皮下移植瘤模型的建立
体外复苏、培养A549细胞，在对数生长期收集细胞。1000 r/min，离心5 min，PBS溶液洗涤2次，离心弃上清，离心管外周以冰袋维持温度在4 ℃左右，以此来保持细胞活性。用生理盐水稀释，调整细胞浓度到5×106个/mL。80只裸鼠按照随机数字法随机分为4组，每组20只，在各组中每只裸鼠右前腋下sc接种0.2 mL。待所有裸鼠的皮下肿瘤的平均直径达到约5 mm时开始给药，每次给药间隔24 h。顺铂组ip给予2 mg/kg顺铂，消岩汤低、高剂量组分别ig给予消岩汤水煎液20、40 g/kg[2]，对照组小鼠ig给予40 g/kg生理盐水。连续给药10 d后眼眶取血法采血。
1.7 消岩汤含药血清的制备
末次ig给药1 h后，小鼠称定体质量，眼眶取血法采血，8 000 r/min，离心15 min，取淡蓝色血清于2 mL EP管中，标识组别。14 000 r/min，高速离心5 min，重复2次。分别提取上清，分装，56 ℃水浴灭活30 min，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，−20 ℃保存。
1.8 Western blotting法检测消岩汤对A549/DDP细胞LRP和MRP1蛋白表达的影响
取对数生长期A549/DDP细胞（2×105个/mL）2 mL于25 cm2细胞培养瓶中，贴壁生长24 h后，PBS洗涤2遍，每细胞培养瓶加细胞培养液8mL及相应的含药血清2 mL，每组设3个复瓶。药物作用24 h后，PBS洗涤2遍，加1 mL胰酶消化细胞，收集细胞于15 mL离心管，1000 r/min，离心5 min，小心弃去上清。收集全部细胞后，在15 mL离心管中加入1mL 4℃预冷的PBS，长吸管反复吹打至单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，小心弃去上清，再重复以上步骤2次，得到不含培养液的细胞。
细胞加适量预冷的蛋白裂解液（RIPA）裂解，匀浆以14 000 r/min，离心15 min，上清转入新管。BCA法测定蛋白量。用PBS将蛋白样品调至等浓度，加6×SDS上样缓冲液，沸水浴5 min备用。
SDS-PAGE电泳：取100 μg处理好的样品，进行SDS-PAGE电泳，积层胶6%，分离胶8%，胶厚0.75 mm。电泳结束后，胶于转移液（含甲醇15%）中平衡10 min；从下至上分别放置滤纸、胶、PVDF膜（0.45 μm）、滤纸，夹子夹好放入倒好转移液的转移槽中，250 mA转膜90 min。将膜取出，放入含5%脱脂奶粉的PBST，室温封闭2 h。对应一抗按照抗体说明书稀释，室温结合2 h；PBST洗3次，每次10 min；二抗1∶10 000稀释，室温结合1 h；分别用PBST和PBS各洗3次，每次10 min。等比例混合显色基质A液和B液，均匀滴加膜上，静置1 min，放入暗箱成像。
1.9 RT-PCR法检测消岩汤对A549/DDP细胞LRP和MRP1基因表达的影响
A549/DDP细胞经不同浓度含药血清作用24 h后收集细胞，提取样本总RNA，用All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，实验操作按产品说明书进行，将RNA模板、试剂盒组分以及RNase-freeWater溶解并置于冰上备用。用ABI7500Fast荧光定量PCR仪检测，采用2−ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。
1.10 统计学方法
采用SPSS 18.0软件，单因素方差分析法（ANOVA）进行统计分析，数据以表示。
2 结果
2.1 消岩汤对A549/DDP细胞MRP1和LRP蛋白表达的影响
A549/DDP细胞经不同浓度含药血清作用24 h后收集细胞提取总蛋白，Western blotting检测MRP1和LRP蛋白表达量的变化。结果表明，与对照组比较，随着消岩汤含药血清中药物浓度的增加，MRP1和LRP蛋白的表达均逐渐减弱（P＜0.05，图1、2），说明消岩汤能够抑制多药耐药相关蛋白的表达，且随着药物浓度的增加，蛋白表达的抑制作用越明显，与药物剂量呈正相关。
2.2 消岩汤对A549/DDP细胞LRP和MRP1基因表达的影响
MRP1基因在各实验组中的扩增曲线图及熔解曲线图说明扩增产物特异性好，实验结果有效。A549/DDP细胞被各组含药血清作用24 h后收集细胞提取总RNA，RT-PCR检测MRP1和LRP的mRNA表达变化，实验重复3次。结果（表1）表明，与对照组比较，经不同浓度消岩汤含药血清作用后，A549/DDP细胞中的MRP1和LRP基因的mRNA水平均有所下降，且随着药物浓度的增加，基因表达抑制的越明显（P＜0.05）。说明消岩汤低、高剂量均可通过调节相关基因的转录而调节对应蛋白的表达。
3 讨论
目前全世界的肺癌发病率与死亡率均高居恶性肿瘤首位[5]。在肺癌的综合治疗中，化疗占有重要的地位，尽管新的化疗药物不断问世，化疗方案日趋完善，但肿瘤细胞的多药耐药性严重限制化学药物的治疗效果。据统计，90%以上接受化疗的肿瘤患者，其死亡与耐药有关[6]，因此对MDR的产生机制、检测方法、逆转方法的研究一直是肿瘤治疗领域的热点。许多专家学者致力于寻找MDR逆转剂，相继开发出tariquidarXR9576，zosuquidarLY335979等逆转剂，但这些药物毒副作用非常明显，效果并不理想，目前国内外还没有一种逆转药物或方法在临床被广泛接受。因此，很多学者看好在中药领域寻找对多药耐药的逆转药物。
中医学认为化疗药物易伤及人体正气，正气亏虚，更易感受邪气。气虚不能行血，使毒瘀更甚，从而导致了化疗的多种副作用，包括多药耐药性的产生。具有“扶正解毒祛瘀”功效的中药复方消岩汤，在配合放化疗或单独应用在稳定患者肿瘤病灶、抗远端转移等方面均有良好疗效，同时在改善证候、提高生存质量、提高免疫功能和改善化疗的毒副作用等方面也有良好作用，是治疗肺癌良好的辅助用药[7-8]。
前期研究证实消岩汤可改善小鼠生活质量，拮抗恶病质，并能够抑制肿瘤生长。消岩汤含药血清对A549及A549/DDP均有生长抑制作用，且能增强顺铂对肺癌敏感细胞和耐药细胞的杀伤作用，具有耐药逆转作用，并且能够诱导肺癌耐药细胞的凋亡[4,9-10]。
MRP是ATP结合盒子超家族运转蛋白成员，其基因位于16号染色体P13.1带上，由长度6.5 kb的碱基组成，该基因编码1 531个氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量为19 000[9]。MRP主要定位于质膜上，能引起一系列不溶于水的药物的耐受，减少细胞内药物的蓄积，增加药物的排出。作为药物泵，能够识别和转运与谷胱甘肽结合的底物，逆浓度梯度排出不溶于水的化合物，MRP过度表达会使肿瘤对多种药物产生耐药性[11]。LRP系人类主要穹隆蛋白复合物，位于16号染色体P13区1带与P11区2带之间，相对分子质量为110 000，是与聚泡相关联的细胞微粒体。LRP使胞质中的药物吸入运输囊泡，通过胞吐方式排出细胞外，从而导致细胞内药物浓度下降[12]。LRP导致耐药的另一机制是将药物从细胞核转移至细胞质，从而降低细胞核内靶点药物浓度[13]。因此，通过抑制MRP1、LRP的表达和功能很有可能成为逆转肺癌MDR的有效方法。本研究证明消岩汤能够抑制LRP、MRP1的表达，且呈剂量依赖性，表明具有“解毒祛瘀、扶正抗癌”作用的中药复方消岩汤逆转肺癌耐药的可能机制为抑制MRP1的功能，改变细胞内药物浓度及通过干扰LRP蛋白功能，升高核内药物浓度，从而逆转MDR。
参考文献（略）
来 源：张 莹，贾英杰，李小江，孔凡铭，杜梦楠，齐晓玉. 消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞多药耐药相关蛋白的调控作用 [J]. 中草药, 2017, 48(13):2717-2722.
