Cell：陈建军/邓晓岚/陈振华等合作开发新型抑制剂，抑制 B 细胞肿瘤生长，增强 CAR-T 疗效

CD3-CD19 双特异性 T 细胞衔接器（贝林妥欧单抗）和靶向 CD19 的嵌合抗原受体-T 细胞（CAR-T）分别在 2014 年和 2017 年获得 FDA 批准上市，这不仅为 B 细胞白血病/淋巴瘤的患者带来了新的希望，同时也掀起了科学界利用 T 细胞治疗各类肿瘤和自身免疫相关疾病的研究热潮。多中心的临床数据显示，经过靶向 CD19 的 CAR-T 细胞治疗后，复发或者难治的（R/R）B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和 B 细胞淋巴瘤（包括弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL），套细胞淋巴瘤（MCL）和滤泡性淋巴瘤（FL）等）虽然取得了 40%-81% 的 complete response rate，但是仍然有大约 20% 的病人不会缓解，而且超过 50% 的缓解病人在接受 CAR-T 细胞治疗仅 1 年以内就会复发。 ^1,2

截止到 2023 年 7 月为止，多个不同临床研究中心的病人长期随访数据表明，五年无事件生存率在 DLBCL 患者中仅为 31%，而在 4-30 岁的 R/R B-ALL 患者中更是低至 25%。 ^3,4 研究发现，最高有 68% 的 B-ALL 患者和 28% 的 DLBCL 患者在经历靶向 CD19 的 T 细胞治疗后，出现 CD19 抗原的低表达或者缺失，这被认为是长期缓解率偏低的重要原因之一。 ^5,6 尽管后来又开发了双靶点的（CD19+CD20 或者 CD19+CD22）的 CAR-T 细胞治疗方案，但是仍然有接近 50% 的 R/R B 细胞肿瘤患者会出现抗原逃脱的现象。 ^7,8 此外，与髓系白血病细胞相比，恶性肿瘤 B 细胞分裂速度要快 5-24 倍。 然而，快速增殖的 B 细胞的线粒体却仅有髓系白血病细胞大约一半的数量，且线粒体的体积也大概只有髓系白血病细胞的三分之一。 ^9,10 所以，正常 B 细胞往往无法突破能量需求的阈值进行快速无限制增殖。 研究表明，线粒体高效的合成 ATP 并提供能量是 B 细胞恶性转化和增殖的关键步骤。 ^9,10 因此，为了使 CAR-T 细胞治疗后的病人达到真正可靠的长期缓解，研究恶性 B 细胞抗原逃脱和线粒体高效产能的分子机制是至关重要的。

YTHDF2 蛋白是第一个被鉴定的 m ⁶ A 修饰的识别蛋白。在很多不同的肿瘤中，这个 RNA 结合蛋白被报道发挥着重要的促癌或者抑癌作用。然而，到目前为止，还没有一个研究非常明确地指出究竟 YTHDF2 在哪一个癌症类型中最具转化潜力。更重要的是，YTHDF2 蛋白通常被认为是通过识别 m ⁶ A 修饰后介导 mRNA 降解，然而在已发表的敲除或者敲低 YTHDF2 的 RNA-seq 数据中，存在着大量被下调表达量的基因。由于不能用 YTHDF2 识别 m ⁶ A 修饰后介导 mRNA 降解的分子机制去解释，这些基因往往被忽视。所以，YTHDF2 是否可以不依赖 m ⁶ A 修饰直接正向调控非 m ⁶ A 修饰的靶基因表达尚不清楚，但很值得系统研究。

2024 年 12 月 17 日，来自美国希望之城国家医疗中心贝克曼研究所的 RNA 研究与治疗中心主任、系统生物学系主任陈建军教授，邓晓岚研究副教授与陈振华博士共同在 Cell 发表题目为 「YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B-cell malignancies」 的研究论文。文章首次揭示， YTHDF2 促进了 B 细胞肿瘤的能量供应和免疫逃脱，并且在正常前体 B 细胞单独过量表达 YTHDF2 可以将其恶性转化为 B-ALL 细胞。YTHDF2 识别 m ⁵ C 修饰的 mRNAs（例如 ATPase 亚基 b, f, g）并通过招募 PABPC1 促进靶基因的稳定从而提高线粒体 ATP 合成，以突破正常 B 细胞的能量障碍。同时，YTHDF2 也可以识别并降解 m ⁶ A 修饰的 mRNAs（例如 CD19 和 HLA-DMA/B 等）促进肿瘤细胞逃避免疫细胞的识别和攻击。利用小分子抑制剂 CCI-38 靶向 YTHDF2 不仅可以抑制恶性 B 细胞的生长而且可以显著地增强 CD19 CAR-T 细胞对复发 B 细胞肿瘤的疗效。 （详见图 1 ）

首先，作者对数千例 B 细胞肿瘤病人样本的 RNA-seq 或者 microarray 等多个数据库的数据分析发 现，在所有经典的 m ⁶ A 修饰相关蛋白中， 只有 YTHDF2 在不同的亚型病人样本中显示出一致性地高表达且是最高表达的 m ⁶ A 修饰相关基因。尤其重要的是，在基于 CRISPR-Cas9 技术建立的 DepMap 数据库中，超过 1000 个不同类型肿瘤细胞的数据显示，对 YTHDF2 依赖性最显著的癌症类别是 B 细胞白血病和淋巴瘤。B 细胞肿瘤病人的生存分析发现，YTHDF2 的高表达往往预示着较短的生存时间。因此推测，YTHDF2 是一个与 B 细胞肿瘤发生发展密切相关的 m ⁶ A 修饰蛋白。接下来，通过利用大量的细胞系、病人来源的异种移植细胞（PDX）细胞，BCR-ABL1 或者 NRAS(G12D) 诱导的小鼠 B-ALL 细胞，作者验证了 YTHDF2 在 B 细胞肿瘤病人样本和细胞系中的的过量表达（主要通过 MYC, STAT3 和 POU2AF1 转录激活表达）而且发现 YTHDF2 是 B 细胞肿瘤体外恶性增殖和体内发病过程所必需的。过量表达野生型 YTHDF2 的健康小鼠前体 B 细胞可在小鼠体内发生恶性转化并发展为 B-ALL 细胞，虽然 m ⁶ A 结合能力完全缺失的 YTHDF2 突变体显著延迟了 B-ALL 转化和发病，但是最终还是会恶性转化，说明 YTHDF2 存在非 m ⁶ A 机制依赖的调控功能。

因此，在分子机制上，通过 RNA-seq 和 m ⁶ A -RIP-seq 的数据，作者首先分析发现， 有 816 个没有 m ⁶ A 标记的基因在敲低 YTHDF2 后出现显著下降的表达量。进一步功能和信号通路聚类分析发现它们显著聚焦到线粒体电子传递链的氧化磷酸化系统，包括一群在细胞核内转录但是蛋白定位在线粒体内膜的电子传递链中的 ATP 合成酶（Complex V）的基因，F-Type ATPase 的亚基基因例如 ATP5PB, ATP5MF, ATP5 MG 等。质谱定量测序细胞代谢物技术及相应的聚类分析、大量的 B-ALL 和 DLBCL 细胞系和 PDX 细胞的体内、体外功能实验研究，确定 YTHDF2 通过调控靶基因 ATP5PB, ATP5MF 和 ATP5 MG 促进线粒体 ATP 产生和线粒体功能，从而促进 B 细胞肿瘤的发生发展。更进一步地，作者结合 RIP 与 UHPLC-QQQ-MS 技术，精确定量了与 YTHDF2 结合的 RNA 上的各种甲基化修饰的丰度，结果表明，除了 m ⁶ A 修饰的 RNA 之外，m ⁵ C 修饰的 RNA 同样也显著地与 YTHDF2 蛋白结合。作者经过进一步的 UHPLC-QQQ-MS，RNA pull-down 实验，m ⁵ C-RIP-seq,  Bisulfite-real-time PCR 联合第三代测序技术纳米孔测序（nanopore-seq），基因位置分析等，证明了 YTHDF2 与 m ⁵ C 的亲和性，转录组基因结合位置的高度重合性，并解析了 YTHDF2 的 RNA 结合口袋中负责结合 m ⁵ C 的关键氨基酸位点和靶基因上被 m ⁵ C 修饰的单个 C 碱基位点。为了理解 YTHDF2 如何稳定 m ⁵ C 修饰的靶基因，作者发现在一项利用 BioID 技术研究细胞质亚结构中（stress granule 和 processing body 等）蛋白质互作网络的研究中， ¹¹ YTHDF2 与 PABPC1 可能互相结合，PABPC1 曾被证明可以稳定 mRNA 的表达量，经典的 m ⁵ C 识别蛋白 YBX1 也正是通过招募 PABPC1 实现稳定 mRNA 的表达。 ¹² 有趣的是，在 B 细胞肿瘤中，PABPC1 的基因和蛋白表达水平，生存分析，促癌功能，上游受到 MYC 等转录调控，下游调控 ATPase 家族基因/线粒体 ATP 生成等方面，均与 YTHDF2 非常地相关并表现出类似的功能。因此，YTHDF2 识别 m ⁵ C 修饰的靶基因的 mRNA 并通过招募 PABPC1 稳定它们的表达，促进 B 细胞肿瘤的 ATP 合成和恶性增殖。这也解释了 YTHDF2 很可能通过提高线粒体产能效率，突破正常 B 细胞的为防止不可控增殖的能量屏障，造成正常 B 细胞的恶性转化。

同时，作者也观察到有 1023 个基因被 m ⁶ A 修饰且在敲低 YTHDF2 后上调表达量， 分析发现，YTHDF2 识别并降解的 m ⁶ A 修饰的靶基因最显著地聚焦在 B-cell-receptor signaling，Interferon Type I signaling 和 T 细胞激活等通路，靶基因包括 CD19 和 MHC-II 分子（抗原呈递分子 HLA-DMA 和 HLA-DMB）等。敲低或敲除 YTHDF2 可以显著地上调细胞表面的 CD19 和 HLA-DMA/B 的丰度，进而提高贝林妥欧单抗和 CD19 CAR-T 细胞对 B 细胞肿瘤的捕获和杀伤能力。作者研究发现小鼠 Ythdf2 缺失之后，不影响正常早期 B 和成熟 B 细胞分化、但是确实降低了 Germinal Center 的 response，提高并激活了 CD4 ⁺ T 细胞等。同时，以前也有报道显示敲除 YTHDF2 可扩大正常造血干细胞比例。 ¹³

因此，YTHDF2 应该是比较理想的治疗靶标蛋白。 本研究开发的小分子抑制剂，CCI-38，选择性靶向 YTHDF2（而不是 YTHDF1 或者 YTHDF3），不仅单独处理就可以显著地抑制肿瘤的进展，而且还可以显著地增强 CD19 CAR-T 细胞对 T 细胞治疗后复发的 B 细胞白血病（CD19 ^low ）的疗效。

来自美国希望之城国家医疗中心贝克曼研究所 RNA 研究与治疗中心主任和系统生物学系主任 陈建军教授，邓晓岚研究副教授和陈振华博士 为本文的共同通讯作者；来自美国希望之城国家医疗中心贝克曼研究所的 陈振华博士， 暨南大学血液学研究所/广州医科大学附属第五医院血液内科的 曾成武教授， 希望之城国家医疗中心贝克曼研究所的 杨露研究副教授和车远博士 为本文的共同第一作者；浙江大学免疫研究所、良渚实验室研究员 肖刚教授、 广州国家实验室研究员 翁桁游教授 和中山大学肿瘤防治中心 黄慧琳教授 等为该研究做出重要贡献。希望之城测序中心，希望之城质谱中心，UCLA 质谱中心，UCLA 代谢物测序中心，辛辛那提儿童医院的 James C. Mulloy 教授及耶鲁大学分子/细胞肿瘤中心主任 Markus Müschen 教授为该研究提供了关键的支撑和帮助。

图 1. YTHDF2 在 B 细胞肿瘤中促进 ATP 合成和肿瘤逃逸

原文链接：https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)01324-2

招聘信息：

希望之城国家医疗中心的陈建军教授和邓晓岚教授课题组长期致力于 RNA 和 DNA 表观修饰、恶性肿瘤发病机制、免疫治疗和小分子或蛋白降解药物开发等基础研究领域。已在 Cell, Nature, Cancer Cell, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Cell Stem Cell, Nature Cell Biology, Science Translational Medicine, Molecular Cell 等期刊上发表一系列重要论文，近期招聘若干名有 RNA 研究、mRNA-based 治疗、肿瘤机制研究、肿瘤免疫、肿瘤代谢、和/或生物信息等背景的博士后研究人员和国际交流访问学者。热烈欢迎志同道合的年轻学者投递简历 (To: [email protected])， 招满为止。