正文
近日，
GPB
在线发表了中国科学院微生物研究所王军研究员
、
中国
中医
科学院广安门医院仝小林院士和赵林华研究员
课题组联合完成的题为
“
Antidiabetic Effects of Gegen Qinlian Decoction via the Gut Microbiota Are Attributable to Its Key Ingredient Berberine
”
的研究论文，我们的
“
要文译荐
”
栏目很高兴邀请到文章第一作者徐
西
占
博士为大
家解读
葛根芩连汤调节肠道菌群治疗糖尿病的研究成果。
要点介绍
•
研究问题：
鉴定中药复方葛根芩连汤中通过调节肠道菌群治疗
2
型糖尿病的关键活性成分，并阐明其可能的作用机制。
•
研究方法：
本研究中，我们以自发性
2
型糖尿病
GK
大鼠为动物模型，共设置
5
组，包括正常
Wistar
大鼠组(
N
组)、糖尿病模型组(
D
组)、二甲双胍治疗组(
M
组)、葛根芩连汤治疗组(
GQD
组)和小檗碱治疗组(
BBR
组)，实验共干预
12
周
。通过
口服葡萄糖耐量试验(
oral glucose tolerence tes
t
，
OGTT
)
评估各组大鼠的葡萄糖代谢改善状况；利用
16S rRNA
基因扩增子测序评估干预前后大鼠肠道菌群的变化，
并进一步
检测粪便短链脂肪酸的变化
；利用回肠转录组测序，比较大鼠
肠道功能的
改变
；利用
Luminex
液相芯片检测大鼠的血清细胞因子水平，评估系统性炎症水平的改善情况；利用实时荧光定量
PCR
，检测大鼠胰岛局部炎症缓解状况。
•
主要结果
1
：
二甲双胍、葛根芩连汤以及小檗碱治疗均
可
显著
降低
GK
大鼠的
血糖
及胰岛素抵抗
水平
。
•
主要结果
2
：
葛根芩连汤和小檗碱治疗均
可
显著改变
GK
大鼠的肠道菌群结构，
促进其向正常菌群结构
恢复，显著富集包括
Faecalibacterium
、
Roseburia
和
Gemmiger
等菌属在内的多种产丁酸细菌，增加乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸含量。
•
主要结果
3
：
葛根芩连汤和小檗碱治疗可显著下调
回肠
免疫相关基因的表达，并上调糖脂代谢
相关
基因表达，从而
调控
GK
大鼠的肠道
黏膜免疫
，提高脂质和碳水化合物的代谢能力。
•
主要结果
4
：
糖尿病
GK
大鼠的系统性炎症水平及胰岛局部炎症水平在药物治疗后显著降低。
背景介绍
糖尿病是一种由遗传因素、表观遗传修饰和环境因素等多种致病因子共同作用所引起的以血糖
升高
为特征，同时伴有
系统性
低
水平
炎症、胰岛素分泌不足或功能障碍的慢性代谢性疾病，从而导致糖、脂肪、蛋白质、水和电解质等代谢紊乱，影响机体的正常生理活动。近年来，随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，
2
型糖尿病的发病率逐年升高，已成为严重危害人民健康的重大公共卫生问题。
大量研究表明，肠道菌群失调在
2
型糖尿病的发生发展过程中发挥着关键的作用，会导致有益菌(如
Faecalibacterium
、
Bifidobacterium
)的减少以及有害细菌(
如
Desulfovibrio
)
的异常繁殖
，从而诱发机体的慢性低
水平
炎症，造成胰岛素抵抗，引起人体的糖脂代谢异常。因此，以肠道菌群为靶点，采用生活方式干预
(
如
饮食
、
运动
等)
、补充微生态制剂(益生菌、益生元和合生元等)、降糖药物、菌群移植等手段，对肠道菌群进行靶向性调节成为防治
2
型糖尿病的新策略。而降糖药物调节肠道菌群的研究最引人注目，特别是对一线降糖药物二甲双胍的研究最为透彻。二甲双胍可以调节肠道菌群，富集产短链脂肪酸细菌，增加短链脂肪酸水平。一方面短链脂肪酸可以刺激肠道内分泌
L
细胞分
泌胰高血糖素样肽-
1
和
酪酪肽
，改善糖脂代谢；另一方面富集的益生菌可以降低肠道通透性，减少脂多糖的含量，从而减轻机体低水平炎症，提高胰岛素敏感性。
中药在调节肠道菌群中也发挥着重要作用。我们的前期研究发现，中药复方葛根芩连汤可通过调节肠道菌群，富集
Faecalibacterium
、
Gemmiger
和
Blautia
等产丁酸细菌而治疗
2
型糖尿病。然而，由于中药复方化学组成分复杂(例如，葛根芩连汤由黄连、黄芩和葛根等多种草药组成，含量较高的活性成分包括小檗碱、黄芩苷和葛根素等)，严重限制了其广泛应用，因而确定该复方中的主要活性成分并阐明其作用机制对于葛根芩连汤的临床应用具有重要的指导意义。巧合的是，二甲双胍的发现便是源于人们对草药山羊豆和山羊豆碱的长期研究探索。
小檗碱，属于生物碱类物质，口服吸收差，可通过富集产短链脂肪酸的细菌，发挥降糖效果。经过大量的文献调研，我们推测小檗碱可能是葛根芩连汤在治疗
2
型糖尿病时与肠道菌群互作的关键活性成分。基于此，本研究以
GK
大鼠为动物模型，通过比较葛根芩连汤和小檗碱在疗效、调节肠道菌群、诱导回肠基因表达谱改变以及改善宿主炎症状态等方面的差异，旨在确认小檗碱是否可作为葛根芩连汤中通过调节肠道菌群治疗
2
型糖尿病的关键活性成分，以期为阐明中药复方调节肠道菌群的作用机制提供新的研究方法与策略。
主要结果
药物治疗可改善糖尿病
GK
大鼠代谢状况
为了探索不同治疗方法对大鼠的影响，我们监测和分析了治疗
12
周期间各组大鼠血糖和体重的变化。由给药期间大鼠体重的动态变化曲线可知，
GK
大鼠(
D
组、
M
组、
GQD
组和
BBR
组)的体重在实验期间的每个时间点均显著低于正常
Wistar
大鼠组(
N
组)(
P
< 0.05
)
。与糖尿病模型组(
D
组)相比，其他三个药物干预组(包括
M
组、
GQD
组和
BBR
组)的大鼠体重无显著性差异(
P
> 0.05
)(
图
1
A
)。血糖变化方面，与
N
组相比，所有
GK
大鼠组的
随机
血糖水平均明显较高。与
D
组相比，药物治疗组血糖水平明显降低(图
1B
)
。
OGTT
试验发现，三个药物治疗组的大鼠峰值血糖糖水平均显著低于糖尿病模型组，且在峰值过后，血糖
水平
下降较为迅速(图
1C
)
。此外，与糖尿病模型组相比，药物治疗组的血糖曲线下面积均显著降低(
P
< 0.01
)，
M
组、
GQD
组和
BBR
组分别减少了
30.3%
、
22.3%
和
19.2%
(图
1D
)，表明药物治疗显著提高了
GK
大鼠的葡萄糖代谢能力。同时，三个药物干预组的空腹血浆胰岛素水平(图
1E
)
以及胰岛素抵抗指数(图
1F
)
也显著降低，表明
GK
大鼠的胰岛素抵抗状况明显改善。
图
1
不同药物治疗对大鼠代谢的影响
药物干预显著改变大鼠肠道菌群结构
肠道菌群测序结果表明，大鼠肠道菌群结构在葛根芩连汤
(
P
= 0.008
，
adonis
检验，以下同)和小檗碱(
P
= 0.009
)干预后发生了显著性改变，而
N
组(
P
= 0.262
)、
D
组(
P
= 0.073
)以及
M
组(
P
= 0.065
)大鼠肠道菌群的总体结构未发生明显变化(
图
2
A
)。具体而言，在基于
Bray-Curtis
距离的
主坐标分析
(
principal co-ordinates analysis
，
PCoA
)
中，药物治疗后，葛根芩连汤和小檗碱组的肠道菌群结构沿主坐标成分
PCoA1
方向上表现出明显的偏离(解释了约
74.16
％的变化)，表明
GQD
和
BBR
治疗后的核心菌群发生了显著变化。有趣的是，
GQD
和
BBR
组大鼠的肠道菌群在治疗后均显示出极为相似的群落结构，并且与正常
Wistar
大鼠组治疗后的肠道菌群结构类似(
GQD
vs.
BBR
：
P
= 0.269
；
GQD
vs.
N
：
P
= 0.855
；
BBR
vs
. N
：
P
= 0.226
)。这些结果表明，
GQD
和
BBR
治疗均能使糖尿病
GK
大鼠的肠道菌群恢复至正常
Wistar
大鼠的肠道菌群状态，而主要活性成分小檗碱可作为改变大鼠肠道菌群结构的主要驱动力。
药物干预
12
周后，
GQD
和
BBR
治疗组均显著富集了
Faecalibacterium
、
Roseburia
、
Clostridium
XIVa
、
Ruminococcus2
和
Dorea
等高丰度产丁酸菌属，以及许多稀有菌属，包括
Parabacteroides
、
Paraprevotella
、
Butyricimonas
、
Alistipes
、
Gemmiger
、
Anaerostipes
、
Collinsella
、
Intestinibacter
、
Fusicatenibacter
、
Phascolarctobacterium
、
Butyricicoccus
和
Coprococcus
等产丁酸菌属(图
2B
)。此外，
GQD
和
BBR
治疗还能显著降低
Helicobacter
等机会性致病菌的相对丰度。相比之下，二甲双胍治疗后富集的菌属种类较少，大多与
GQD
和
BBR
组中富集的菌属重叠，例如
Clostridium
XIVa
、
Ruminococcus2
、
Dorea
、
Clostridium sensu stricto
和
Phascolarctobacterium
等。然而，我们还观察到
D
组大鼠与
M
组具有极其相似的菌属富集谱，表明这些富集的菌属很可能是由于
GK
大鼠肠道菌群随时间成熟而被富集，而与二甲双胍的治疗无关。以上结果表明，
BBR
作为
GQD
的主要活性成分，在调节肠道菌群方面的能力与
GQD
极其相似，可以显著富集包括
Faecalibacterium
和
Roseburia
在内的产丁酸菌属。
图
2
药物干预前后大鼠肠道菌群的改变
葛根芩连汤和小檗碱治疗
显著增加粪便短链脂肪酸水平
为进一步确认富集的菌属是否确实增加了丁酸的含量，我们接下来测量了各组大鼠粪便中短链脂肪酸(包括乙酸、丙酸和丁酸)的浓度。结果表明，
GQD
和
BBR
治疗后，两组大鼠粪便中的乙酸、丙酸和丁酸含量均得到显著增加(
P
< 0.05
)，而
M
组的短链脂肪酸水平在干预前后均未发生显著变化(
图
3
A
−
C
)。此外，药物干预后，
GQD
组的乙酸水平显著高于其他四组(
P
< 0.05
)，而丁酸水平与
N
组的含量相当，显著高于
D
组、
M
组和
BBR
组(
P
< 0.05
)。以上结果表明，
GQD
和
BBR
治疗后大鼠粪便中短链脂肪酸水平显著升高，这和两种药物能显著富集产丁酸菌属的结果相一致。
接着，我们对各组大鼠粪便中短链脂肪酸的水平与肠道菌群的菌属相对丰度之间的相关性进行了分析，并采用热图对
Spearman
相关系数进行可视化展示。从总体上看，粪便短链脂肪酸水平，尤其是丁酸，与上述
GQD
和
BBR
组富集的多个产丁酸菌属的相对丰度呈正相关，而与一些丰度降低的潜在致病菌属的相对丰度呈负相关，例如
Helicobacter
(图
3D
)。这些结果表明，短链脂肪酸的含量与相应实验组肠道微生物组成变化高度一致，提示
GQD
和
BBR
治疗显著富集的菌属增加了短链脂肪酸的含量。
图
3
大鼠粪便短链脂肪酸含量在药物干预前后的
变化
葛根芩连汤和小檗碱治疗改变了回肠基因表达谱
先前研究表明，肠道菌群可以调节胃肠道上皮细胞中的基因表达。
GQD
和
BBR
治疗后，
GK
大鼠肠道菌群发生了显著改变，因此我们进一步通过比较转录组学分析来确定不同处理组之间大鼠回肠基因表达谱的差异。首先，我们将
4
组
GK
大鼠间两两比较获得的
855
个差异表达基因(
DEGs
)根据其在
4
组中的基因表达模式进行聚类分析，得到
4
个
Cluster
(
图
4
A
)。
接着，我们将分属
4
个不同
Cluster
的
DEGs
分别进行
GO
富集分析
(
图
4B
)
，发现
Cluster 1
的
DEGs
主要富集许多与免疫激活相关的
GO terms
，例如
“T cell activation”
(
Cd3d
、
Cd3e
、
Cd8a
、
Fyn
、
Lck
、
Zap70
和
Cd28
等基因
)
，而
Cluster 2
富集的
GO terms
与细胞因子产生和分泌有关
(
Ccr5
、
Irf4
、
Il17a
、
Tlr8
、
Foxp3
和
Il17f
等基因
)
。有趣的是，我们发现
Cluster 1
和
Cluster 2
中的
DEGs
主要由
GQD
和
BBR
组中显著下调的基因组成，这暗示了
GQD
和
BBR
治疗在减轻肠道炎症中的潜在作用。
Cluster 3
中的
DEGs
富集一些与脂质和碳水化合物代谢有关的
GO terms
，例如
“fatty acidmetabolic process”
(
Apoa1
、
Apoa4
、
Apoa5
、
Apoc3
、
Angptl4
、
Cyp2b1
、
Cyp2d2
、
Cyp2d3
、
Cyp2d5
、
Cyp4a1
、
Slc27a2
和
Adh7
等基因
)
和
“carbohydrate transport”
(
Slc2a2
、
Slc2a5
、
Slc2a7
、
Slc5a1
、
Slc5a4
、
Slc5a9
、
Aqp1
、
Aqp7
和
Lct
等基因
)
。
Cluster 4
也富集了一些脂质代谢相关的
GO terms
，例如
“long-chain fattyacid metabolic process”
(
Cyp2b2
、
Cyp2c23
、
Cyp2c6v1
、
Cyp2j4
、
Cyp4f18
、
Cd36
和
Pnpla3
等基因
)
。鉴于
Cluster 3
和
4
中的
DEGs
在
GQD
组和
BBR
组中均显示了相对较高的表达量，这些结果表明
GQD
和
BBR
处理后
GK
大鼠的脂质和碳水化合物的代谢能力显著改善。
此外，我们对
4
个
GK
大鼠实验组间两两比较
(
M
vs.
D; GQD
vs.
D; BBR
vs.
D; GQD
vs.
M; BBR
vs.
M; BBR
vs.
GQD
)
的
DEGs
进行
GO
富集分析
(
图
4C
)
。
GQD
和
BBR
治疗均显著下调了免疫反应相关的
GO terms
，并上调了对金属离子的反应、药物及长链脂肪酸代谢过程等
GO terms
，这和上述基因表达模式聚类的富集结果一致。此外，通过这
4
组之间的比较转录组学分析，我们观察到
GQD
和
BBR
治疗对
GK
大鼠具有相似的
GO term
富集图谱，而在
M
vs.
D
和
BBR
vs.
GQD
比较中，均只有很少的
GO terms
被富集，这表明二甲双胍治疗对宿主的影响弱于
GQD
和
BBR
。同时，
GQD
和
BBR
组间的
DEGs
仅富集
5
个
GO terms
，并且完全由上调的
DEGs
富集，包括“
purine nucleoside monophosphate biosynthetic process
”、“
GMP metabolic process
”、“
hydrogen ion transmembrane transport
”和“
cellular metabolic compound salvage
”等。
进一步，我们将
3
个治疗组与
D
组的
DEGs
通过韦恩图分析鉴定各组共有或特有的基因列表
(
图
4D
)
。
GQD
和
BBR
组中有
169
个共有的
DEGs
，几乎占两组
DEGs
数目的一半
[GQD
：
49.3%
(
169/343
)
；
BBR
：
50.1%
(
169/337
)
]
。有趣的是，除基因
Unc93a
外，其他
168
个共有的
DEGs
均显示出一致的基因表达趋势
(
与
D
组相比，其表达量显著下调或上调
)
，表明
GQD
和
BBR
对
GK
大鼠回肠转录组的影响极其相似，这也与前述大鼠的表型数据、肠道菌群差异等结果相一致。这
169
个共有的
DEGs
主要富集许多免疫相关和少量糖代谢相关的
GO terms
，并对
2
个代表性显著富集的
GO terms
，即“
positive regulationof immune response
”(
GO:0050778
)和“
carbohydratetransport
”
(
GO:0008643
，用红星表示
)
中
DEGs
的表达谱进行展示，发现属于调节免疫应答的
GO terms
的基因表达量显著下调，而参与碳水化合物转运的基因表达量则显著上调，表明
GQD
和
BBR
治疗可通过相似的机制缓解糖尿病，即减轻炎症并改善大鼠糖代谢能力。
综上所述，回肠转录组数据表明，
GQD
和
BBR
治疗可以显著减轻
GK
大鼠回肠的炎症，并可能通过改变肠道菌群来改善脂质和碳水化合物的代谢。
图
4
不同大鼠处理组间回肠转录组学的比较
药物治疗显著降低
