Fig.1系统剖析黑色素瘤的糖基化及相关糖基化基因
作者是通过怎么样的系统生物学方法来筛选到FUT8这个分子的？Fig.1A就介绍了筛选的思路：
作者利用凝集素芯片对肿瘤转移前和转移后的样本进行分析，找出发生显著变化的糖基化的亚类。找到后再找介导这种变化的基因，找到后再去研究功能，分了三步走。
第一步：用凝集素芯片找在原发灶和转移灶中哪几类糖基化的亚类发生了显著变化。
筛选的结果中，作者将在原发灶中高表达，转移灶中低表达的糖基化类型用绿框表示；而在原发灶中低表达，转移灶中高表达的糖基化类型用红框表示，当成股票涨跌就很好记。所以通过凝集素芯片作者找到有4大类的糖基化亚类发生了显著变化。
第二步：原发灶和转移灶中，检测糖基化相关基因改变。
将筛选出来的基因通过黑色素瘤的细胞株进行功能验证，用的方法是siRNA。
可以看到，把FUT1、FUT2敲减掉后，肿瘤的侵袭性明显上升，而敲掉FUT8后肿瘤的侵袭性会明显下降。
第三步：把FUT1、FUT2、FUT8介导的不同糖基化的过程做了个模式图。
FUT8介导的是N核心岩藻糖基化，这种糖基化可以被LcH、PSA识别，对FUT1/FUT2介导的是α-1,2这种的岩藻糖基化，可以被UEA-I、TJA-II和SNA-II所识别。
既然FUT1/FUT2和FUT8都有明显的变化，为什么作者最后只着重研究了FUT8呢？因为，对于药物开发来说，FUT8的价值更大。 FUT8在转移灶中明显上升，如果有办法阻断FUT8，那就能阻断肿瘤的转移。
接下来作者要通过免疫组化的方法验证FUT8和它介导的糖基化亚型在组织中的情况。
可以看到在转移组织中LcH识别的岩藻糖基化表达明显升高，而UEA-I识别的岩藻糖基化表达是明显降低的。
Fig.2 FUT8沉默导致黑色素瘤细胞侵袭能力下降（in vitro）
找到了FUT8这个分子后就要开始研究功能，先做离体实验。
在细胞系中敲减了内源性的FUT8，通过LcH染色发现LcH阳性明显下降，说明FUT8介导的N核心岩藻糖基化得到了抑制。
FUT8被敲减后，对于细胞的增殖基本不受影响，但可以明显抑制细胞的侵袭。
Fig.3 FUT8沉默导致黑色素瘤体内侵袭能力下降（in vivo）
作者接下来做在体实验，也就是动物实验。先在细胞外大量的扩增细胞，然后把这些细胞做一个移植瘤模型，等移植瘤形成后，在第17天把原发灶的移植瘤切除。到42天如果还能观察到肿瘤细胞，那就是转移形成的肿瘤。再把转移灶取出做离体的培养和观察检测。
在42天检查转移灶的结果，FUT8被敲除后，转移灶的平均荧光强度和总荧光强度都明显的下降了。
通过离体和在体实验都证实了FUT8的表达和转移是密切相关的。敲减了FUT8，细胞侵袭都会受到抑制。接下来作者要验证FUT8的表达和转移灶的维持是否有相关性。
Fig.4 FUT8沉默损伤体内转移瘤的生长
作者构建了一个全新的载体，只有在培养基中加入多西环素，这个载体中的FUT8相关shRNA才会表达。
检验流程和在体实验差不多，现在体外大量培养肿瘤细胞，皮下接种，第17天切除原发灶肿瘤，第42天检测转移的情况。然后给小鼠喂多西环素再敲减细胞内的FUT8，看对已发生的转移灶有没有影响。
在不加多西环素的时候，小鼠体内到处都是转移灶，而加了之后，基本上不发生肿瘤转移。这说明对于已经形成的转移灶，敲除FUT8后，转移灶也会消亡。
Fig.5 TGIF2调节FUT8的转录
以上的实验把FUT8已经研究完了，接下来要知道什么原因让FUT8在转移灶中升高。
作者研究了FUT8甲基化的状态，发现在原发灶和转移灶中没有变化；也没有基因突变，也没有拷贝数变化。最终作者研究了FUT8的转录水平是不是受到转录因子调控，通过生物信息学找了FUT8的启动子区域，并做了筛选。最后发现只有TGIF2在敲减后能显著抑制FUT8的表达。
体外实验也证实了，敲减TGIF2后，FUT8的表达明显下降。LcH识别的N核心岩藻糖基化水平也受到了明显抑制。
最后作者还统计了TGIF2和FUT8的表达相关性，两者有非常明显的正相关性。
那要怎么证明TGIF2就是通过转录因子调控FUT8的？作者做了两个实验， ChIP和Luciferase，作者通过生信软件分析，找到了TGIF2的结合位点，并在附近设计了3对Primer。对TGIF2进行富集，再通过ABC三对Primer做PCR，如果DNA序列能被富集下来，那PCR的检测也应该是阳性。
结果发现，TGIF2和FUT8可以发生直接的相互作用，接下来通过Luciferase证明了是通过转录的形式调控FUT8表达量。
Fig.6 通过鉴定黑色瘤核心岩藻糖蛋白揭示侵袭和转移的调节因子
FUT8上游可以通过转录的形式受到TGIF2的调控，那么下游呢？接下来作者就要研究这个。
之前已经明确了，FUT8的作用是要介导N核心岩藻糖基化，那就要找下游到底是什么分子的N核心岩藻糖基化受到了FUT8的调控。筛选出了114种蛋白，进行了GO分析，找到了3个和转移相关的蛋白做进一步分析。
FUT8可以调控NRP2以及L1CAM的N核心岩藻糖基化。
Fig.7 L1CAM1 是FUT8促侵袭调节因子
接下来的问题是，L1CAM1能否介导黑色素瘤转移呢？也就是说FUT8是不是通过促进L1CAM1的岩藻糖基化来促进肿瘤转移。
在L1CAM1过表达的情况下，敲除FUT8能够抑制肿瘤的侵袭。
同样，过表达FUT8，敲减L1CAM1，对肿瘤细胞的侵袭，也有明显抑制。
最后，作者得到的结论就是FUT8表达上升后，会导致L1CAM1的N核心岩藻糖基化水平上升，这时的L1CAM1不能被蛋白酶识别剪切。
