蓝晶实验室•iGEM项目解读系列 | 2013 TU-Munich

自工业革命以来，水生生态系统受到大量人为污染物的污染一直是个问题。抗生素，激素和各种有毒物质威胁着环境健康，这些有毒物质不能通过传统的废水处理有效地去除。以新的科学技术保护环境免受进一步伤害并扭转已经造成的破坏迫在眉睫，其中，生物修复和植物修复是非常有前景的方法。TU –Munich团队选择了 Physcomitrella 作为底盘细胞开发了一套在水生环境中实施的过滤器装置并研究了这种新技术的应用及其经济可行性，这种方法有望以低成本、可持续的方式改善全球水质。

苔藓 Physcomitrella 是一种陆生植物苔藓植物，结构简单，主要栖息在阴凉潮湿的地方，是一种常用的植物模式生物。在应用层面，植物的整体适用性要高于细菌等微生物，而且作为自养生物，将 Physcomitrella 过滤器放到各地之后所需要的维护成本更低。在国际苔藓库存中心（IMSC）中有很多 Physcomitrella 突变体和转基因菌株供研究使用。而在生物反应器中，苔藓可用作动物细胞培养物的替代物来简单、廉价和安全地生产复杂的生物药物。最终，项目选择了具有生命周期短、结构简单、同源重组高效等优点的 P. patens 作为底盘细胞。

Physcomitrella的生命周期（左）和Moss生物反应器（右）

若将 P. patens 用作Phytoremediaton的底盘，必须使其能够在不同的区室中表达效应蛋白，包括细胞质表达、外泌表达以及固定化表达三方面。细胞质表达通过克隆Actin_5启动子下游的相应BioBrick来实现；为实现效应子外泌表达，项目选择了 P.patens 中SERK受体的信号肽；最后，通过构建基于SERK受体的合成受体实现重组效应蛋白的固定。

P. patens 中效应蛋白定位概述图

此外，为了形成可以降解不同效应分子的定制苔藓，项目引入了SpyCatcher / SpyTag系统，该系统基于SypCatcher和SpyTag的残基的侧链之间形成的共价键来实现翻译后蛋白质融合，SpyCatcher和SpyTag通过对化脓性链球菌的FbaB结构域进行分裂和工程化产生，分裂的部分彼此识别并形成共价的异肽桥。

通过SpyCatcher / SpyTag系统组成两种酶的融合蛋白的定位过程的步骤

项目还从Promega的NanoLuc萤光素酶中创建了BioBrick BBa_K1159001，该part包含的 NanoLuc荧光素酶比传统的萤火光素酶亮度高240倍，但大小却比其他萤光素酶小至少2倍。 这使得NanoLuc荧光素酶成为完美的报告蛋白，不仅可以用于验证正确的定位，还可以在需要低检测阈值时使用。

NanoLuc荧光素酶的同源结构（3ppt_A）

生物降解是指（微生物）生物转化或改变环境中的化学物质的过程，本项目主要通过将废水中的有害物质降解或转化为无害化合物来实现生物降解。TU –Munich团队，选择了三种有效的酶整合到 P. patens 中作为可以自我维持生物体，以创建功能性水过滤系统。这三种酶分别是：（1）红霉素酯酶，用来降解大环内酯类抗生素；（2）漆酶，可以降解几种有毒物质，如避孕药的主要成分乙炔雌二醇；（3）儿茶酚-2,3-双加氧酶，催化芳香族污染物的降解。实验结果显示该系统表达的红霉素酯酶B能够成功降解大环内酯类抗生素红霉素，项目还结合酶动力学模型对PhyscoFilter进行了应用可行性的分析。

处理后的污水（上）和地表水（下）中药物的浓度对比

本项目以 P.patens 作为底盘，构建了可以特定结合和处理污染物的过滤器，为了能够持续去除目标污染物，过滤器中的效应物必须是膜锚定的。污染物固定到膜上后，效应物的内化会导致污染物在细胞中的代谢或积累，而在积累的情况下，就需要对细胞进行受控处理。本项目选择了三种不同种类的结合蛋白示例，每种蛋白利用不同的机制结合蛋白质：（1）anticalin fluA结合蛋白；（2）谷胱甘肽-S-转移酶，催化目标污染物与另一分子（谷胱甘肽）之间形成共价键；（3）蛋白磷酸酶1，结合蛋白靶标。

生物累积系统原理

本项目开发了一种光触发开关，通过将开关活性限制在适当的过滤光谱中来防止意外的环境扩散。这个系统中，在蓝色滤膜下培养转基因苔藓，这样苔藓就不会吸收红光，所以开关会保持活性。一旦苔藓从这个受保护的环境中逃逸，就会出现红灯并启动灭活开关。该系统被模块化为传感器模块和自杀模块。传感器结构域由分裂的TEV蛋白酶组成，与蛋白质PhyB或PIF连接。当存在红光时这两种蛋白质二聚化并因此导致两种分裂的TEV亚基的二聚化，由此开始重构TEV蛋白酶。自杀模块由核酸酶组成，该核酸酶通过含有核定位信号（NLS）和TEV切割位点的接头锚定在细胞内膜上。一旦传感器模块被红光重建，TEV蛋白酶就切割膜定位的核酸酶处的切割位点。因此，核酸酶被释放，由核定位信号而被转运至细胞核，并最终使基因组断裂杀死细胞。

步骤1：通过红光重新分裂TEV蛋白酶并释放NLS标记的核酸酶

步骤2：核酸转运核酸酶和破坏遗传物质

本项目选择了苔藓细胞作为底盘，与常规的微生物底盘相比就添彩不少，同时，该团队开发了一系列针对苔藓细胞做基因改造的方法，在这个过程中既开发了新元件也对前人的元件进行了改造和完善，这都是iGEM比较推崇的。在生物安全上，TU-Munich团队开发了光触发自杀开关，应用十分方便。项目最终形成了一套基本完整的水处理过滤器并对其在应用方面做出了评估，虽然实验结果不尽完善，但瑕不掩瑜，无论从创新性和应用性上都值得学习。