今天跟大家分享的是一个经久不烂的主题“吸烟”，一直以来大家都明白吸烟有害健康这个道理，今天就让我们从外泌体的角度看看吸烟是如何有害健康的。

吸烟是一种已经风靡全球的习惯，并且吸烟也是许多疾病（包括心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病COPD、哮喘和肺癌）的重要危险因子。对于烟草对健康影响的评估和理解在全世界都是重大关切问题，也是重要的社会关注问题。发现新的可能与COPD或肺癌发生相关的生物学指标可以更好的观察暴露于烟草的人群，这要归功于病理过程中的可逆性阶段的筛选。在本研究中，作者想知道：是否吸烟会改变人类肺泡灌洗液（BALs）中的细胞外囊泡（EVs）的miRNA谱？这是否会影响周围正常支气管上皮细胞的状态？为此，作者获取了10个吸烟者和10个非吸烟者的肺泡灌洗液，并且从上清中提取出了细胞外囊泡（EVs）。接着作者将10个吸烟者和10个非吸烟者的肺泡灌洗液的EVs中的miRNA进行了比对，并且进行了统计学的分析，分析讨论是否吸烟造成的生物学差异，从而对于将BAL的EV中的miRNA作为烟草暴露者潜在的生物标记物进行评估。最后，作者检测了吸烟者和非有吸烟者支气管上皮细胞的EVs比较吸烟对于细胞状态的影响。作者的研究第一次发现在人类样本中吸烟可以改变肺的EV谱，并且这会影响周围支气管上皮细胞。

背景介绍

香烟含有7000种化学物质，由于它的高毒物浓度，它成为了对健康最有害的室内空气污染物之一，并且在2012年被IARC（国际癌症研究机构）归类于I类的致癌物。烟草每年杀死将近一半以上的吸烟者（每年约600万人死于吸烟）。烟草通过直接与呼吸道粘膜接触从而作用于机体，同时悬浮颗粒的堆积作用也引起机体的可持续效应。反复的烟雾暴露会损伤呼吸道的表皮屏障，最终诱导过度的炎症反应，同时也伴有肺表皮细胞表型的改变。这回导致慢性阻塞性肺疾病（COPD）的恶化，并且它与更高的肺肿瘤发生几率相关。然而吸烟造成肺部病变的机制十分复杂，至今还没有了解的很清楚。

EVs包括一系列的纳米大小的膜囊泡（外泌体，微囊泡，微粒子，凋亡小体等），它们从大量的正常或者疾病细胞中分泌释放入组织液。分析EVs和它们的成分可能能够作为疾病诊断的生物标记物，由于EVs反映了细胞来源的成分，在正常和疾病组合之前存在差异，并且可以很可靠的检测到。EVs因此可以作为多种疾病（比如癌症）的生物标记物，并且通过检测这些生物标记物可以用于癌症病人疾病的早期评估和诊断。EVs确实含有mRNA和非编码RNAs，比如miRNA等。miRNA由20--22个核苷酸组成，它可以通过与靶mRNA的3’UTR（非翻译区）结合从而抑制蛋白的表达，这会造成转录抑制或者mRNA的降解，并且它可以在不同类型的细胞之前传递，也可以作为癌症的生物标记物。

EVs和它们内容的miRNA抑制可细胞外信使促进COPD、哮喘疾病的进展，或者促进肺癌的形成。在2003年，Admyre 等人首次报导 EVs在肺泡灌洗液（BALs）中出现。在气道微环境中，不同的环境刺激因子（比如香烟烟雾）可以调节这些EV的释放和它们的 成分的改变（miRNA和蛋白）。比如，循环中存在的肺内皮细胞来源的EVs可能是香烟烟雾暴露后反应肺损伤和炎症的潜在的生物标记物。而且，吸烟者的血中更高水平的微粒子代表着早期的肺气肿。最近有报道，偶尔吸烟的 人（每月少于10支烟）短暂暴露于香烟与循环中潜在的促炎症微粒的释放有很大关系。吸烟似乎也会导致健康个体血浆中微粒内miRNA谱的改变；尤其miR-21（与癌症进展相关的miRNA），在暴露于香烟烟雾提取物的人类支气管上皮细胞释放的外泌体中升高。但是知道现在，也没有关于吸烟者肺泡灌洗液的EVs，它们的组成成分和对支气管细胞的潜在影响的研究（与非吸烟者进行对比）。

在本研究中，作者评估了吸烟者和非吸烟者 肺泡灌洗液 来源的 EVs内的miRNA谱以及对支气管上皮细胞的影响的差别。接着，作者分别给予BEAS-2B细胞吸烟者和非吸烟者的BAL内分离得到的EVs。作者发现吸烟者的EVs具有特殊的miRNA谱并且出现了miR-21, miR27a, let-7e 以及 let–7 g 表达的改变，也出现了它们的靶 mRNA表达的改变，比如磷酸酶和PTEN，NRF2，HMGA2或者其它与肺部疾病形成相关的基因比如KRAS，VEGF，EZH2，IL-6等等。它们也诱导促炎症细胞因子IL-6和IL-8的释放以及特异性肺癌生物标记物CYFRA21-1的释放。这些结果让我们能够更好的理解在疾病到来之前吸烟对于肺部疾病形成的机理。

RESULT

1.从吸烟者和非吸烟者肺泡灌洗液中分离得到的EVs和它们的表征。

从 10个吸烟者和10个非吸烟者BALs的上清分离得到EVs。BALs的细胞组成经过检测在吸烟者和非吸烟者之间没有明显差异。作者为了证实提取的确实是EVs，分别用纳米粒子追踪分析（NTA），透射电子显微镜（TEM）以及用借助外泌体的markersCD9，CD81，CD63做WB进行验证。从 Fig.1A 可以看出吸烟者和非吸烟者拥有大小非常一致的 EVs群体，大约直径为139nm。这些结果进一步通过TEM得到证实，透射电子显微镜下课件EVs是圆形的囊泡，直径大约为30-200nm之间（ Fig.1B ），接着作者再通过 WB验证外泌体marker进行验证（ Fig.1C ），虽然表现出异质性，但是在大部分的吸烟者个非吸烟者的样品中都清晰表达了 CD81，CD9和CD63。

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2.吸烟者EVs拥有特殊的miRNA谱

小 RNA包括从BAL 的EV中提取的miRNA。（ Fig.2A ）作者选取了 11个miRNAs（具体见原文Table4）作为肺癌发生的潜在生物标记物或者作用因子。作者通过RT-qPCR实验对吸烟者和非吸烟者EVs的miRNA的表达的差异进行比较。经过分析这些miRNA的表达改变的水平，作者最终决定miR-16作为EVs中miRNA定量的最佳参考基因，没选择经典的RNU6B是因为它没有发现差异并且已经报道过了。这个分析向大家展示了吸烟者和非吸烟者的EVs的miRNA谱之间的差异（ Fig.2B ）。 10个检测了的miRNA中有3个在吸烟者和非吸烟者之间存在明显差异。Let-7e, let–7 g 和 miR-26b 这三个物质吸烟者的 EVs中比非吸烟者明显减少 （ Fig.2C ）。剩余的 7个miRNAs没有表现出明显的差异。

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3.吸烟者的EVs对于人类支气管上皮细胞BEAS-2B的miRNA表达的影响。

作者为了检验是否吸烟者的 EVs使吸烟者和非吸烟者支气管上皮细胞的miRNA表达谱产生差异。作者将BEAS-2B分别用10个吸烟者和10个非吸烟者的BAL的EVs处理24h。然后用RT-qPCR的方法分别检测miR-21, miR-27a, Let–7 g 和 Let-7e 这四个 miRNA的表达（这四个miRNA常常作为肺癌的生物标记物） （ Table4 ）。 从 Fig.3 作者告诉我们 miR-21, miR-27a 的表达在那些暴露于吸烟者 EVs的BEAS-2B组细胞明显升高（与非吸烟者组对比）。而Let–7 g 和 Let-7e 的表达在用吸烟者 EVs处理的组内明显下降。

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4.吸烟者的EVs对于人类支气管上皮细胞BEAS-2B的miRNA表达的影响。

许多 mRNA都被miR-21, miR-27a, Let–7 g 和 Let-7e 这四个 miRNA靶向。在这些靶mRNA中作者检测了PTEN（一个被miR-21靶向的肿瘤抑癌基因）、NRF2（一个关键的抗氧化剂调节因子和肺癌形成过程中一个应激反应因子），HMGA2（一个在肺癌病理形成过程中重要的癌基因，受let-7miRNA家族高度调节）。如Fig.4所示，PTEN和NRF2在用吸烟者EVs处理过的BEAS-2B细胞内明显下调，这个减少与它们的靶miRNA miR-21和miR-27a呈明显的负相关 （ Table.5 ）。相反的， HMGA2的表达在吸烟者EVs处理过的细胞中增加（即使增加的不太明显）。有趣的是IL-6R mRNA表达在吸烟者EVs处理过的组也增加，并且它与 Let–7 g 和