CasX(也称为Cas12e)是一种2类CRISPR-Cas系统，与广泛使用的Cas9和Cas12a相比，它的体积更小，在基因组编辑中显示出前景。
虽然CasX- sgRNA-DNA三元配合物的结构已经被解析并揭示了一个独特的NTSB结构域，但CasX的动态行为尚未得到很好的表征。
2024年7月12日，清华大学陈春来、
刘俊杰
共同通讯在
Nucleic Acids Research
在线发表题为
“
Conformational dynamics of CasX (Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET
”
的研究论文，该研究
表征了CasX从非特异性结合到找到靶点并完成切割的动态过程，揭示了其独特的机制，
为未来的蛋白质工程开辟了一条新的途径。
研究采用单分子和生化方法研究了两个CasX同源物DpbCasX和PlmCasX从DNA结合到靶切割和片段释放的构象动力学。研究结果表明，CasX以相对不可逆的动力学顺序切割非目标链和目标链。两种CasX同源物具有不同的剪切模式和特异性。CasX的动态特性还揭示了PAM-近端种子区，为基于CasX的效应器设计提供指导。
进一步的研究阐明了为什么sgRNA和NTSB结构域的修饰会影响其活性的机制基础。有趣的是，CasX的有效目标搜索效率低于Cas9和Cas12a，这可能是其基因组编辑效率较低的原因。
CRISPR-Cas系统提供了对细菌和古细菌入侵核酸的适应性免疫。
CRISPR- Cas系统的免疫应答发生在外源核酸片段掺入CRISPR位点区、CRISPR RNA (crRNA)表达、靶标干扰三个阶段。在靶标干扰步骤中，crRNA与Cas蛋白组装形成核糖核蛋白(RNP)干扰复合物，引导Cas核酸酶到达其互补靶标进行切割。CRISPR-Cas系统的RNA引导DNA靶向功能使各种基因组工程工具的开发成为可能。根据效应蛋白的组成，CRISPR-Cas系统可以分为两类。1类系统需要多个Cas蛋白来实现干扰，而2类系统只需要一个多结构域Cas蛋白。
Cas9和Cas12a都是2类效应物，广泛用于各种细胞类型和生物体的基因组编辑。
通过宏基因组分析从地下水细菌中鉴定出CasX (Cas12e)，属于2类系统。它特异性识别5'-TTCN PAM，并在人类细胞中与单导RNA (sgRNA)结合时显示出相当大的基因组编辑功效。
与Cas9和Cas12a相比，CasX的大小约为980个氨基酸，为AAV介导的递送提供了更大的便利。CasX已经证明了与Cas9和Cas12a一起作为替代基因组编辑工具的巨大潜力。尽管使用RNA引导DNA靶向，CasX除了存在RuvC核酸酶结构域外，与Cas12a或Cas9的蛋白质序列相似性极小。据报道，CasX-sgRNA-DNA三元复合物的冷冻电镜(
cryo-EM
)结构证明，CasX使用单个RuvC结构域来切割目标链(TS)和非目标链(NTS) DNA。这种机制类似于Cas12a。两个独特的CasX结构域对DNA剪切至关重要：靠近TS的目标链加载(TSL)结构域，以及靠近NTS的非目标链结合(NTSB)结构域。
NTSB结构域是DNA解绕所必需的，生化分析证实了这一点。CasX与其他Cas蛋白之间的结构差异表明CasX利用不同的机制。
图形摘要（图源自
Nucleic Acids Research
）
两种同源蛋白，来自Deltaproteobacteria的CasX(以下简称DpbCasX)和来自plantomycetes的CasX(以下简称PlmCasX)，在研究中被广泛使用。
它们具有68%的蛋白质序列同一性，可以利用相同的sgRNA，然而，在原始sgRNA(称为sgRNAv1)存在的情况下，纯化的PlmCasX的切割活性明显低于DpbCasX。PlmCasX的结构分析显示，它的螺旋结构域与sgRNA的支架柄几乎没有结合，而DpbCasX的支架柄与它的螺旋结构域紧密结合。为了解决这个问题，一种新的sgRNA被命名为sgRNAv2，其支架柄的灵活性增加，导致切割活性和编辑效率显著提高。
尽管取得了这些进展，CasX在活细胞中仍然表现出有限的编辑效率。
低温电镜分析和生化分析大大增加了对CasX的了解。然而，它在靶向和切割过程中的综合动态特性仍不清楚。
通过单分子荧光共振能量转移(FRET)实验，观察到CasX在切割过程中有三种不同的构象状态：R-loop起始状态、R-loop形成后非靶标链（NTS）切割状态和靶标链（TS）切割状态。
DpbCasX和PlmCasX在DNA切割过程中表现出不同的动态行为，突出了它们在NTS切割位点和靶特异性上的差异。
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae604/7712616
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