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基因治疗CMC避坑指南｜专题七：阶段性适应的检测方法的建立，验证及方法变更

医药速览 · 公众号 · · 2024-09-01 08:30

正文

众所周知，近年来基因治疗迅猛发展，已有数十款药物陆续上市。国内的研发管线也在爆发中，陆续有产品进入IND/BLA的审批阶段。FDA在药品审批时需要申请人提供基因治疗产品完整的CMC信息。CMC信息涵盖保障产品安全、鉴别、纯度、规格、效价这些质量属性。

我们发现临床研究的各个阶段都有可能因为CMC问题导致hold，BLA阶段也会因为CMC问题导致退审。例如在Zolgensma的 BLA中，一共收到了64份IR，其中CMC相关共有38份，涵盖生产工艺、分析方法、稳定性等各个方面。据了解全球范围内因为CMC问题被延迟审批的占比在80%左右。比例之高令人咋舌，也让行业从业人员愈发重视CMC。

然而中国的基因治疗行业发展还处于早期阶段，CMC人员缺乏专业的知识体系和经验，对技术和法规的把握都不够，给项目推进到商业化带来潜在巨大风险。为此，同写意联合基因治疗专业CDMO行诚生物赋能行业，推出【基因治疗CMC避坑指南】系列内容，旨在帮助行业人员系统学习CMC各个板块内容，快速补齐CMC短板，避免在CMC问题上踩坑走错路走弯路。

系列内容将分别从以下四个模块十个专题详细阐述：

基因治疗工艺开发

1.病毒载体的生产细胞选择及变更

2.病毒载体的生产上下游工艺的选择

3.质粒生产的污染及交叉污染风险解析

分析方法开发

4.rAAV载体的基因组滴度测定及方法变更

5.生物活性分析方法的建立，验证及变更

6.复制型腺相关病毒rcAAV的检测及验证

7.阶段性适应的检测方法的建立，验证及方法变更

质量控制和申报要求

8.阶段适应性的质量体系建立

9.基因治疗产品药学部分注册申报资料和技术要求

CDMO选择

10.基因治疗CDMO选择指南

（关注我们，及时学习后续更新内容）

专题七

阶段性适应的检测方法的建立，验证及方法变更

腺相关病毒（AAV）因其能够感染广泛的组织且具有较低的免疫原性和较低的整合能力，被认为具有较好的安全性，因而rAAV成为在基因治疗领域最前沿、最有潜力和最常用的病毒载体之一。rAAV的研发与申报过程需经过多个阶段，每个阶段都有其特定的要求和目标。为确保rAAV的安全性和有效性，适应不同申报阶段的检测方法的建立、验证及变更显得尤为重要。

本期内容就将探讨阶段性适应的检测方法的建立，验证及方法变更。内容将从rAAV在不同申报阶段（临床前研究、IND申请、临床研究及上市申请）的检测方法构建、验证与变更过程进行详细阐述，相信对大家会有帮助。

基因治疗药物rAAV申报阶段概述

基因治疗药物rAAV的申报过程通常包括临床前研究、IND申请、临床研究及上市申请等阶段。每个阶段都需要对rAAV进行全面而严格的检测，以评估其安全性、有效性及质量稳定性。

不同申报阶段检测方法的建立

临床前研究阶段

新药研发是一个渐进的，要求逐步严谨的过程，在研发的初级阶段应当恰当地把控好药物研发的质量，相应的分析方法开发和验证也要做到恰如其分，避免资金浪费。在临床前研究阶段，主要关注rAAV基因滴度、感染滴度、空壳率和相关宿主杂质等方面检测方法的开发。在此阶段可以建立一些通用的检测方法进行多批次小试工艺样本的检测，选择合适的生产和纯化工艺，进行动物实验或毒理实验，选择合适的目标样本进行后续的工艺放大摸索及生产。例如基因组滴度在此阶段可以使用通用的ITR引物和探针进行测试。

IND申请阶段

在IND申请阶段，需要建立初步的质量标准和分析方法，确保rAAV的质量和安全性。这包括衣壳滴度、基因组滴度、空壳率、感染滴度、生产及工艺相关杂质、安全性等多方面的检测。通过ELISA、qPCR、ddPCR等方法，可以准确测定rAAV的滴度；通过AUC可以检测rAAV的空壳率；通过细胞感染实验，评估rAAV的生物活性。

在此阶段需要对方法学进行相关的确认，尤其是关乎临床剂量的检测方法基因组滴度，建议选择目的基因GOI设计引物和探针进行方法开发，需要进行详细的方法学验证，确保方法的准确性和稳定性。如果是药典方法，可以做相应的优化确保适用于检测样本，如果是全新开发的方法，建议进行相应的方法学确认。针对内毒素和无菌检测，中国和美国申报所需要的阳性菌种和鲎试剂类型也是不同的，需要在方法开发和验证阶段都要考虑到，确保符合申报国家的要求，也可以使用符合两国或多国要求的合并方法进行方法验证和检测，降低检测次数和工作量。相应的质粒、rAAV原液和成品的检测方法如下表（1）~表（3）：

表（1）质粒放行检测方法

表（2）rAAV原液放行检测方法

表（3）rAAV制剂放行检测方法

异常毒性*为中国申报必检项目，FDA申报不需要

临床研究及上市申请阶段

在临床研究和上市申请阶段，需要对rAAV进行全面而严格的质量控制。这包括建立整体的质量控制和中间控制的策略，确保每批rAAV产品都符合预定的质量标准。通过严格的验证过程，可以确保检测方法的准确性和可靠性，为rAAV的安全性和有效性提供有力保障。全面系统的方法学验证研究通常在关键性临床试验期间完成，至少需要在工艺性能验证(process performance qualification，PPQ)之前完成，以支持商业化规模的工艺验证、临床试验期间变更的可比性研究以及上市申请所拟定的质量标准。如果在临床试验期间发生分析方法的转移或变更，应规范完成变更前后的桥接研究。

针对rAAV目的蛋白含量和生物学活性的检测，需要在三期临床前进行建立，并在BLA前完成相应的方法学验证，确保在商业化阶段能够使用更灵敏的方法评价产品的活性和药效。所有的非药典检测方法都需要进行全面的方法学验证，如果涉及到方法的转移，还需对新的检测实验室进行评估和方法的再验证工作，确保方法能够得到稳定的转移。企业也需要一定的原辅料和内包材的检测能力。

检测方法的验证

药品质量标准分析方法验证(analytical method validation)的目的是证明采用建立的方法适合于相应检测要求。在建立药品质量标准时，分析方法需经验证;在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。在建立药品质量标准、变更药品生产工艺或制剂组分、修订原分析方法时，需对分析方法进行验证。方法验证的理由、过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。

分析方法的开发和确认研究完成后，需要开展全面的方法学验证工作，以证明该分析方法适用于预期目的。对于采用《中华人民共和国药典》2020年版四部通则收载的常规检查项目，应进行适用性研究; 若对药典方法经过修订或替代，需进行对比研究确认其合理性。

方法学验证中通常考虑的验证指标包括专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限、耐用性等。方法学验证可以参照ICHQ2(R2): “分析方法验证”[10]、《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》、《中华人民共和国药典》2020年版通则9101《分析方法验证指导原则》以及通则9401《生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则》、USP通则〈1225〉“分析方法验证”等国内外指导原则来规范开展。相关方法学验证试验选择如表（1）和图（1）。

表（1）方法学验证项目汇总

图（1）方法学验证流程图

检测方法的变更

在申报过程中，随着对rAAV研究的深入和申报要求的变化，可能需要对检测方法进行变更。变更过程应遵循科学、规范的原则，确保变更后的检测方法能够满足新的申报要求。具体步骤包括评估变更需求、设计新的检测方法、验证新方法以及更新相关文件和记录等。对于产品的生产场地变更、生产规模放大、增加新剂型、生产工艺重大变更等可能影响产品质量的情况，需要对分析方法的适用性进行重新评估。

同时，随着分析检测技术手段的升级，越来越多自动化程度高、重现性好、灵敏度高的分析方法用于替代传统分析方法，研究者可以结合技术的迭代更新对分析方法进行持续改进。如果研究者提出新的分析方法，应进行全面的风险评估，根据变更的潜在风险确立变更风险等级、变更研究策略和新方法的控制策略。研究者可从以下方面开展研究: 提供变更分析方法的理由和依据; 对新方法进行全面的方法学验证; 采用变更前后的分析方法对代表性样品进行比对分析，从而确定变更前后分析方法的等效性; 根据比对研究结果评估原有质量标准是否适用于更新的分析方法。

如果申请人提出新的分析方法，应进行全面的风险评估和评价，以确定对性能的影响。应建立新方法的分析方法控制策略。在报告变更时，应证明与新方法相关的合理性。

变更应有学科规划，有序的开展研究。早起研发数据有限，主要基于研发经验进行可预期的规划。随着临床数据的获得和药学研究数据的积累，还需要对规划进行相应的完善和细化。另外变革也需要阶段性的考量，以不增加临床受试者安全性风险为前提，前期药学研发数据支持后期临床试验开展；早期临床试验阶段，需结合临床进程，着重关注安全性风险。原则上，临床试验期间药学变更应在确证性临床试验完成前完成（有临床数据支持）。

临床试验期间安全性、有效性数据的逐步获得，质量控制体系也逐渐得到完善。风险评估在不同临床试验阶段、不同类型、不同类别生物制品中存在差别。通常越到临床试验后期的药学变更，随着现有临床试验充分论证的难度越大，相应的风险等级可能也随之提高。因此，应遵循具体情况具体分析的原则，综合分析、判断生物制品变更的潜在风险因素和关联影响。

详细分析方法变更评价表见表（2）。

表（2）分析方法变更评价表

— 结论 —

药物研发从早期到后期是一个渐进过程，科学性、合规性以及满足区域性要求贯穿整个生命周期，也是药物研发中必须重视的难点与痛点。而无论是从临床前处方研究，还是临床研究；无论是国内还是欧美，产品的质量控制标准及分析方法的验证，都没有统一固定的要求。随着行业发展，相应的质控标准和方法验证也遵循不断完善、越来越严格的规则。通过科学、规范的操作和严格的质量控制，可以确保rAAV的质量和安全性，为其申报和临床应用提供有力支持。因此在对既定法律法规非常熟悉的情况下，不断地学习和丰富的经验才能更好地把控不同制剂产品研发阶段质量控制和分析方法学验证把控。

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