结合代谢表型和基因表达谱鉴定西瓜果实发育过程中控制有机酸和糖代谢的关键基因网络
期刊：
Horticulture Research
发表时间：
2020.12
IF：
5.404
近日，
Horticulture Research
在线发表了中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜遗传育种课题组刘文革团队题为
Identification of key gene networks controlling organic acid and sugar metabolism during watermelon fruit development by integrating metabolic phenotypes and gene expression profiles
的研究论文。
迈维代谢提供了转录组，初生代谢物，及联合分析服务
。
西瓜是全球第五大消耗最多的果肉水果，果实富含水分和营养成分（氨基酸、糖、类胡萝卜素、番茄红素、有机酸等）。糖和有机酸对果实感官品质有重要影响，是果实风味形成的关键成分。与以最终产量为最终目标的主食作物不同，口味和香气是西瓜更重要的特性，两者均由水果的代谢产物决定。在生长过程中，西瓜果实发生了许多生化变化，包括糖代谢，有机酸和色素积累，水果软化，风味和芳香族挥发性成分的变化。有机酸是保持水果pH值和改变水果感官品质的关键因素。果实成熟度的评价取决于糖酸比以及品种的品质。西瓜中主要的糖和有机酸是果糖和苹果酸。
组学方法和定量生物学的进展提供了几种方法来识别生命系统中的基因网络及其调控机制，其中一种利用mRNA-Seq数据识别共表达基因网络的有前途的方法是加权基因共表达网络分析(WGCNA)。
WGCNA用于鉴定共表达基因的模块/网络，将这些模块与表型性状联系起来，并检测网络中的关键基因
。这种方法以前曾被用于发现负责果实酸度、口感，杏和苹果黄烷醇生物合成，化合物芳香性质的共表达基因。然而，目前还没有用该方法来解释西瓜果实有机酸和糖调控的基因网络和分子调控机制。本研究利用RNA测序数据揭示了甜西瓜和酸西瓜授粉后10、18、26和34天糖和有机酸的调控网络和机制。
分别对SwtW（甜西瓜）和SrW（酸西瓜）在10、18、26和34天测量TSS（可溶性固形物）。在不同发育阶段存在显著差异。在SwtW和SrW中，TSS分别从10 DAP的4.13和5.60 Brix%增加到34 DAP的12和10.5 Brix%(图1a)。
西瓜果实发育过程中可溶性糖含量(葡萄糖、蔗糖和果糖)存在显著差异。SwtW中10、18、26、34天葡萄糖含量分别为11.6、37.01、30.83、13.43 mg/g FW，SrW中10、18、26、34天葡萄糖含量分别为17.76、32.15、26.05、16.54 mg/g FW。两个材料中，从10天到18天，葡萄糖含量增加，但第34天，葡萄糖含量与10天相同(图1c)。两个材料中，果实发育各阶段的果糖含量变化趋势相同，分别为15.86、46.04、60.86和52.17；17.16、40.17、56.75和50.77 mg/g FW(图1d)。这些结果证实，随着果实走向成熟，果糖和葡萄糖被分解，产生各种代谢过程和果实成熟所需的能量。两个材料中，蔗糖含量在10 DAP时很低，但在18、26 和34 天时显著增加(图1e)。
苹果酸作为两种材料观察的主要有机酸。两个材料中，苹果酸含量从10 -26 天显著增加(图1f)。成熟期，苹果酸含量在SrW中有所下降，但仍高于SwtW。在26天，柠檬酸浓度非常高(图1g)，但在成熟后降低。草酸在SwtW和SrW中的浓度在10dap较高，但在接近成熟时有所下降(图1h)。
图1. 西瓜果实在10、18、26和34天的总可溶性固形物(Brix %)、pH值、可溶性糖(葡萄糖、蔗糖和果糖)和有机酸(苹果酸、草酸和柠檬酸)(mg/g FW)
对两个样本4个发育阶段（10,18,26,34DAP）的西瓜果实进行转录组分析。相同发育阶段不同材料下调基因高于上调基因，相同材料不同发育阶段比较上调基因多于下调基因。
不同发育阶段的差异基因的kegg分析显示，次级代谢产物生物合成，淀粉和蔗糖调节代谢，戊糖和葡萄糖酸根相互转化，泛素介导的蛋白水解，萜类骨架生物合成，糖脂代谢，类黄酮的生物合成，脂肪酸的生物合成，伸长和降解以及抗坏血酸和藻酸盐代谢等通路注释丰富。苯丙氨酸类生物合成，甘油磷脂代谢，MAPK信号通路，次生代谢物生物合成，蔗糖和淀粉代谢，代谢途径以及植物病原体相互作用途径得到了显着富集，并且在西瓜果实发育过程中持续的上调。
转录组的WGCNA模块分析显示，基于单个基因的共表达模式，鉴定出11个不同的基因模块。这些基因模块以不同的颜色标记，并以簇图和网络热图的形式呈现（图2a）。
在每个发育阶段，将TSS，pH和葡萄糖，蔗糖，果糖，苹果酸，柠檬酸和草酸含量用作表型数据，以分析模块性状相关性
。构建了样本树状图和特征热图，以说明每个表型参数在不同发育阶段的表达（图2b）。
图2 a.进行共表达模块计算的聚类树状图和基因网络热图。b.各发育阶段的树状图和模块性状热图
在11个共表达的基因网络中，有3个与糖和有机酸具有显着相关性。
蓝色模块包含1301个基因，并显示出与蔗糖的显着关联，相关系数（r
2
）为0.92。黄色模块包含410个基因，与果糖（r
2
= 0.79）和葡萄糖（r
2
= 0.83）正相关。棕色模块由741个基因组成，与苹果酸（r
2
= 0.75）和柠檬酸（r
2
= 0.85）高度相关。基因模块和性状相关性的详细描述如图3a，b所示。从这3个模块中选择基因，并使用WGCNA R软件包计算其边缘和结点以进行基因网络可视化。
为了进一步寻找基因网络内主要贡献的候选基因，从西瓜参考基因组注释数据库中提取了所有这些基因的注释信息。
挑选差异基因中的模块枢纽基因并与注释信息比较的综合方法，筛选出23条候选基因，进行RT-qPCR验证，以精确识别关键候选基因。这些基因包括15个与糖代谢有关的基因，6个与苹果酸代谢有关的基因，2个与柠檬酸代谢有关的基因
。RT-qPCR和RNA-Seq数据的结果相互一致。最后，鉴定了来自黄色模块的3个基因（Cla97C01G000640，Cla97C05G087120和Cla97C01G018840）与葡萄糖（r
2
= 0.83）相关，被鉴定为糖转运蛋白（SWEET，EDR6和STP），还有1个基因（Cla97C03G064990）与蔗糖（r
2
= 0.92）相关，从其他作物可获得的信息中被鉴定为蔗糖合酶（SS）。同样，来自棕色模块的3个基因(Cla97C07G128420、Cla97C03G068240和Cla97C01G008870)与苹果酸(r
2
= 0.75)和柠檬酸(r
2
= 0.85)具有很强的相关性，分别被标注为苹果酸盐和柠檬酸盐转运体(ALMT7、CS和ICDH)。这些推测的候选基因在基因网络中被用红色高亮标出(图3c-e)。
根据(1)细胞内显著性(糖和有机酸相关模块中的中心基因)和(2)基因表达谱被确定为关键候选基因。
图3 西瓜果实发育过程中糖和有机酸调控的基因网络和关键候选基因
被鉴定为与糖代谢相关的重要基因对果实发育各个阶段的性状有相当大的影响。SrW与SwtW有5个与蔗糖合酶（SS）相关的基因和4个与蔗糖磷酸合酶（SPS）相关的基因表达差异。其中一个蔗糖合酶基因(Cla97C03G064990)也在蓝色模块中存在，该基因与蔗糖含量高度相关(r
2
= 0.92)。
2个蔗糖磷酸合酶基因(Cla97C06G120770和Cla97C11G215270)的表达模式与4个发育阶段蔗糖含量的表达模式一致
。结果表明，5个果糖激酶(FK)、4个果糖二磷酸醛缩酶(FBA)和4个果糖1-6二磷酸(FBP)基因在西瓜果实发育的不同阶段存在差异表达。
FK (Cla97C05G094630)、FBA (Cla97C04G076620)和FBP (Cla97C08G147060)的表达模式与果糖在不同发育阶段的含量一致
。中性转化酶(Cla97C05G088310)下调。5-己糖激酶(HK)基因中，Cla97C03G063270和Cla97C11G208480表达上调。在筛选的12个SWEET基因中，只有WMSWEET1（Cla97C01G000640）在整个西瓜果实发育过程中都被上调。糖转运蛋白EDR6（Cla97C05G087120）和STP（Cla97C01G018840）的表达在早期阶段显示下降趋势，但在果实发育的最后阶段，观察到它们的表达显着增加，表明它们在增加糖运输和积累中的作用（图4）。
苹果酸是西瓜中的关键酸，被认为在形成酸味和降低pH值中起着关键作用。在转录组数据中总共发现了8个ALMT基因，但是只有ALMT7（Cla97C07G128420）与棕色模块一致，并且与苹果酸含量显着相关。该基因在SrW中的表达高于在SwtW中。苹果酸合成中涉及的一种基因，即苹果酸合酶（Cla97C03G054690）在SrW中比在SwtW中高表达。2个苹果酸脱氢酶基因（Cla97C06G125760和Cla97C05G103110）和1个PEPC基因（Cla97C11G223580）的转录水平在开发的早期阶段增加，但后来保持稳定。还发现一种跨膜苹果酸转运的基因（Cla97C02G049340）被上调。对于苹果酸降解，2个丙酮酸激酶基因（Cla97C04G076530和Cla97C11G218660）显示了显着的表达增加。在棕色模块中发现了一个柠檬酸合酶基因（Cla97C03G068240），在与柠檬酸合成有关的转录组数据中发现了一个异柠檬酸脱氢酶基因（Cla97C01G008870）。这两个基因的表达与四个发育阶段的SrW和SwtW中的柠檬酸含量一致（图4）。
为了进一步验证与糖和有机酸转运相关的候选基因，研究了11个西瓜品种的表达谱。根据糖和有机酸的遗传多样性选择这11个材料，研究不同类型西瓜的表达模式。在这些基因型中，Egusi和Amarus的TSS和pH值较低，食籽西瓜的TSS和pH值较低，改良系的TSS和pH值较高。通过RT-qPCR检测共表达网络中7个关键候选基因在4个发育时期(10、18、26、34 DAP)的表达谱。
与酸相关的基因在TSS和pH值较低的材料中表达较高。与糖转运相关的基因在具有高pH和TSS值的种质中高表达，这与低酸含量和高糖含量一致
。因此，我们的结果证实，
SWEET，STP，ERD6，SS，ALMT7，CS和ICDH是与西瓜果实发育过程中糖和有机酸的运输和调控相关的潜在候选基因
（图5）。
图5. 测定了11份西瓜果实不同发育时期糖和有机酸相关候选基因的pH、TSS和qRT-PCR表达
本研究利用RNA测序数据揭示了授粉后10、18、26和34天酸西瓜(SrW)和甜西瓜(SwtW)糖和有机酸的调控网络和机制。通过分析差异表达基因(DEGs)和共表达网络，揭示了与酸和糖代谢相关的基因网络。
在原有转录组+代谢组基础上，升级为转录组+代谢组，转录组+蛋白组，蛋白组+代谢组，转录组+蛋白组+代谢组。多种组学数据系统整合，从原因到结果全方位解析动植物生长发育变化，为不同需求老师提供多个产品，多种研究思路。
