天然酶，以其高催化效率、高底物特异性和可持续性等卓越优势，作为绿色催化剂在纺织、生物燃料、生命支持系统、食品、制药以及医疗设备等领域中被广泛应用。然而，在实际应用过程中，天然酶面临一系列棘手难题。当外界环境中的温度、pH 值或者溶剂等发生改变时，酶的结构易应激受损，从而降低催化性能，极大地限制了天然酶在工业领域的大规模推广应用。与此同时，酶出色的水溶性也为其循环利用设置了重重障碍。酶固定化（将酶固定在多孔载体上）可提高酶稳定性和延长循环寿命，为酶催化剂的发展带来新可能。在酶固定化领域中，物理吸附法凭借操作简便等特性，在工业生产中依旧是常用且通用的技术手段，相关商业产品如Novozym®435已在市场上得到广泛应用。然而，物理吸附法存在着酶装载效率低、固定不够紧密以及酶易泄漏等先天性缺陷。尽管已有众多相关应对策略，但常伴随酶活性降低、孔堵塞而限制底物扩散等新问题。因此，开发一种能够原位实施、经济高效且适用于大规模生产的策略，增强物理吸附法固定化酶体系在工业环境中的稳定性和使用寿命，成为了当前该领域亟待攻克的关键课题。
硅基基质具有化学惰性、机械强度高和热稳定性好等优良特性而被广泛用于酶固定化。朱伟教授团队长期致力于硅基基质在酶固定化及调控生命体活动等方面的研究，并取得了一系列成果（PNAS. 2024, 121, e2408273121; PNAS. 2024, 121, e2322418121; Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202406110；Nat. Rev. Bioeng. 2024, 2, 282; ACS Nano 2022, 16, 2164；Nat. Commun. 2022, 13, 6265；J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 17, 6305等）。在此工作中，朱伟教授团队提出了一种新概念——硅基无机胶水。该概念旨在原位强化固定化酶的结构，同时增强多孔载体与酶之间的相互作用，且不会对酶的原始活性产生不良影响，从而进一步提升固定化酶的稳定性和使用寿命。其核心原理是利用酶蛋白和多孔载体的官能团诱导硅化作用（图1）。
图1.上图：蛋白质催化硅化反应的示意图，该过程原位强化固定化酶的结构，并增强酶与载体材料间的相互作用。下图：描绘固定化酶在三种不同硅化状态下的催化活性和泄漏情况。基于原位硅化法的“硅基无机胶水”具有以下几大优势：1）强化酶结构：固体无机二氧化硅与酶在单酶水平上进行杂交，有效强化酶的结构，显著增强固定化酶对外部环境变化的抵抗能力（图2）。
图2. a）AFM测量不同浓度的硅前驱体硅化前后GOx的体积变化图：b）在各种恶劣条件下处理后 0、10、20 和 40 mM硅化组的剩余活性：60°C 、氧化剂（5 M 尿素）和冻融循环（从 -80 °C 15 分钟到 +35 °C 2 分钟）。2）优化酶与载体基质的相互作用：多孔载体孔壁表面的官能团（如氨基）能够催化硅化反应，随后与发生硅化的酶相结合。这一过程如同 “胶水效应”，极大地加强了酶与支持基质之间的相互作用，有效防止酶泄漏，显著延长固定化酶的循环寿命（图3）。3）避免孔隙堵塞：该方法在引入多孔载体的二氧化硅时，用量极少且能够实现高度精准控制，有效避免孔隙堵塞这一常见问题，确保底物和产物在孔隙通道内能够顺畅无阻地扩散，维持化学反应的高效进行（图3）。
图3. a）EMG、EMGT-1和EMGT-2透射电子显微镜和部分放大。b） EMGT-1的 EDS 元件分析图。c）EMG和EMGT-1的PXRD图像。d）EMG和EMGT-1的77 K氮吸附等温线。e）EMG和EMGT-1的孔径分布曲线。f）EMG、EMGT-1和EMGT-2的回收稳定性。在各种恶劣条件下处理后EMG、EMGT-1和EMGT-2的相对活性：g）5 M尿素。h）60 °C和 i） 冻融循环（从−80 °C 15分钟到+35 °C 2 分钟）。为研究原位硅化对物理吸附法固定化酶体系的影响，研究人员通过调节硅烷浓度来研究硅化程度对固定化酶体系的影响，结果显示40 mM硅化24 h的半固定状态（EMGT-1）明显提高葡萄糖氧化酶在介孔有机框架中的稳定性和使用寿命，经过8次循环后的剩余活性比仅固定化组提高44.51%。然而，80 mM硅化的24 h的全固定化状态（EMGT-2）在循环使用测试过程中，酶活性均低于未硅化组EMG，猜测可能是由于过度硅化，导致多孔框架孔道缩小，进而阻碍底物和产物的扩散。结果表明原位硅化过程是高度可控的，适当的硅化可以加强酶与基质之间的相互作用，进一步增强固定化酶的循环能力和稳定性（图3）。4）具备成本效益与可扩展性：能够直接应用于现有的工业固定化酶系统，无需对现有生产设备进行大规模改造，为工业生产提供了一种经济实惠、高效便捷且易于扩展的解决方案，大大降低了企业的生产成本和技术升级门槛。为了验证酶和载体通用性，研究人员以葡萄糖氧化酶、脂肪酶和青霉素G酰基转移酶为模型酶来研究硅基无机胶水对介孔MOF和微孔树脂固定化酶体系的硅化强化作用。介孔MOF为固定化载体时，8次循环后，与仅固定化组对比，脂肪酶和青霉素G酰基转移酶的剩余酶活分别提高18.24%和7.15%。商用微孔树脂LXTE-705为固定化的载体时，固定化加硅化的葡萄糖氧化酶的循环使用能力和稳定性同样得到增强，60 oC孵育1 h后其的剩余酶活性是游离酶的2.5倍(图4)。
图4. a）TLL 的图和大小。b）EMT 和 EMTT 的回收稳定性。在各种恶劣条件下处理后游离TLL、EMT和EMTT的相对活性：c）70 °C和d）冻融循环。e）PGA的图和大小。f） EMP和EMPT的回收稳定性。在各种恶劣条件下处理后游离PGA、EMP和EMPT的相对活性：g）50 °C和 h）冻融循环。i）GOx@Resin 图。j）RG 和 RGT 的回收稳定性。在各种恶劣条件下处理后游离GOx、RG 和 RGT 的相对活性：k）60 °C和l）冻融循环（从 -80 °C 15 分钟到 +35 °C 2 分钟）。总得来说，基于原位硅化法的“硅基无机胶水”强化固定化酶体系的策略，从酶和载体的角度都证明其具有广泛的适用性，有望为酶固定化领域引入一种新的技术，为具有成本效益的工业工艺开辟新道路，从而拓宽酶的应用前景。以上相关成果以“Robust Immobilization and Activity Preservation of Enzymes in Porous Frameworks by Silica-Based “Inorganic Glue””为题发表于《Advanced Materials》上，该论文共同第一作者为华南理工大学生物科学与工程学院博士研究生郑观生和硕士研究生周壮，通讯作者为华南理工大学生物科学与工程学院朱伟教授。该研究得到了国家自然科学基金等项目支持。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adma.202407831
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