一文了解质粒的常用组成元件

1952年，美国的生物科学家Joshua Lederberg第一次引进了质粒（plasmid）这一术语，用来表示染色体以外的基因物质。质粒是双链DNA片段，能够自我复制，并且通常携带基因[1]。20世纪70年代，随着限制性内切酶，DNA连接酶，凝胶电泳的发现与发展，质粒渐渐变成了分子生物学领域的重要工具，质粒也渐渐的开始被称为载体（vector）。利用质粒，科学家们不但可以很容易的操作并且研究基因，还可以利用质粒表达生产各种蛋白质。

今天科学家们所使用的质粒有各种各样的尺寸，各不相同的功能，但每一个质粒都包含一些重要的基本元件。对于一个质粒，最简单的形式应该包括一个复制起始位点，一个抗性基因，至少一个酶切位点。这些元件可以保证质粒在细菌内的扩增，同时允许携带质粒的细菌从从不含质粒的细菌中进行分离。另外，限制酶切位点允许能够将DNA片段插入到质粒中。下面我们来看一下质粒中常见的一些元件[2]。

ORI（Origin of replication）是一段DNA序列，质粒复制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于这段序列，然后DNA的双链被分开，复制随即开始。质粒必须是能够复制的，否则随着细菌的生长和分裂，单个细胞中质粒的数量将会被迅速稀释。关于ORI的详细信息和实例介绍，请见BioEngX的知乎专栏文章：质粒的前世今生（https://zhuanlan.zhihu.com/p/26589849）。

抗生素抗性基因的存在有两个作用。质粒转化过程的效率其实是非常低的，平均10000个细胞中只有一个可以转化成功。如果没有一个快速的筛选手段，从10000个细胞中找到这一个，是要把人累死的。因此，抗生素抗性基因存在的第一个作用就是，快速筛选。在含有抗生素的培养基中培养细菌，能够生长的就是含有目的质粒，因为，不含质粒的细菌已经被“杀死”了。

另外，我们需要认识到一个事实，从细菌的角度来看，质粒的存在是不利的，因为细菌不得不消耗更多的资源来进行外来质粒的复制，所以转化成功的质粒有可能会丢失掉。抗性基因的另一个作用就是不断给转化成功的细菌施加压力，必须要携带质粒，否则就不能够在含有抗生素的培养基中生存，因此在培养转化成功的菌体时，不要忘了添加抗生素哦！

多克隆位点（Multiple Cloning Site）这是一段短DNA片段，包括多个限制性酶切的单一位点，便于外源基因的插入。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。在表达型质粒中，MCS常处于启动子的后面。

启动子是能够使基因进行转录的一段DNA序列。启动子可以被RNA聚合酶辨别，并开始转录。启动子常位于目的基因上游100-1000bp位置处，是质粒非常重要的一个元件，它决定着目的基因可以在何种细胞中进行表达，也决定蛋白质的表达量。

RNA聚合酶催化DNA转录成RNA。在细菌中，只存在一种RNA聚合酶。然而，真核生物中则有RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ三种不同酶，分别催化不同种类型RNA的合成，而且不同的酶识别不同的启动子。这就意味着，质粒上的启动子类型必须与目标RNA相互对应。如果为了基因表达，我们需要mRNA，那么质粒上就要有RNA聚合酶Ⅱ启动子。启动子也需要与宿主细胞类型相互对应，细菌启动子与真核启动子不可互用。启动子还分不同的类型，有些启动子可以一直工作，而有些启动子是需要进行调控的。另外，启动子有强弱的区分，这会直接影响蛋白质的表达量。

篇幅有限，我们只简单介绍。组成型启动子（constitutive promoter）就是一直工作的启动子，这类启动子用于组成型蛋白质的持续表达，不受时期、部分、环境的影响，这类启动子一般比较弱。诱导型启动子通常比较强，这类启动子受到外界条件诱导后开始工作。启动子的强弱主要跟其与RNA聚合酶相互作用的强弱或者RNA聚合酶量的多少有关系。强启动子常常直接或间接影响着RNA聚合酶的产量。

一小段DNA片段，用来进行质粒的PCR扩增或者测序。

抗生素抗性基因主要是细菌内质粒的筛选标记。对于其他的细胞类型，有些质粒上还会含有其他的选择标记。比如酵母中常用的营养缺陷筛选（auxotrophic selection）。营养缺陷型指的是生物不能够自主合成某种生长必需的有机化合物，这些生物能够在含有这种特殊化合物的培养基中生长，但在缺少这种化合物时不能生长。对于营养缺陷型的菌株，配合使用与之相对应的质粒，质粒中有能够合成这一物质的基因，含有质粒的菌株可以在缺少成分的培养基中生长，不含质粒的菌株则不会生长。

[1] Lederberg J (1952). "Cell genetics and hereditary symbiosis". Physiol. Rev. 32 (4): 403–430. PMID 13003535

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