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微生物与人类生活息息相关，除了在环境中遇到各类微生物之外，我们的身体也离不开微生物。据统计，成人肠道含有100万亿微生物，其基因数是人基因数的100倍，总重量在1.5 kg左右(Jesse D, 2013)。
因此，K Ray曾诙谐地表明，“我们更像是微生物而不是人，我们与肠道菌群之间并非朋友关系而是更亲近—我们已经‘嫁给’它们”（K Ray, 2012）。
图1 我们更像是嫁给微生物
（图片来源《
Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology
》）
既然“嫁给”了微生物，我们就要对微生物有充分的了解，宏基因组技术则是了解微生物群落结构和功能的利器。
随着基因组测序成本的降低，更多的专家学者倾向于通过大数据来分析物种多样性、功能基因、构建代谢通路等。然而现在，利用宏基因组大数据量却可以完成传统技术无法解决的问题，即Contig Binning的分析方法解析那些无法纯培养微生物的基因组。
Contig Binning是基于宏基因组测序序列，将组成相似或丰度一致的Contigs聚类到同一物种从而完成单菌的草图组装，再利用常规的生物信息分析的方法解析基因组的功能。
因此，对于那些难以培养的微生物，利用Contig Binning的生物分析方法可获得它们的基因组草图。
以下是近几年发表的用Contig Binning的分析方法组装难培养微生物的文章，可供大家参考：
图2 基于
Contig Binning分析方法的系列文章
既然Contig Binning的分析策略可以完成难培养的微生物基因组草图，那它的研究思路究竟如何？
事实上，无论是环境微生物还是人体微生物，都可以通过Contig Binning的方法进行研究，并得到高质量的微生物基因组。
早在2012年就有专家学者针对肠道微生态样本进行了Contig Binning组装，并获得了高质量的微生物基因组。
Mads曾在《Nature Biotechnology》发表了一篇题为《Genome sequences of rare, uncultured bacteria obtained by differentialcoverage binning of multiple metagenomes》的文章，并呈现了Contig Binning的组装思路：
图3 Contig Binning的组装思路
（图片来源《
Nature Biotechnology
》）
Step1：
样品准备
Step2：
两种不同的方法提取DNA（热酚提取与非热酚提取），因此不同的微生物组分会有不同的相对丰度
Step3：
PE 150测序（HP+和HP-分别获得29G和57G高质量测序数据）
Step4：
宏基因组组装，得到非冗余的scaffolds序列
Step5-8：
计算两种提取方法中每个scaffolds的丰度，并进行均一化处理；同时计算Teltranucleotide频率、GC含量、是否是保守的单拷贝标记基因（如16S rDNA序列）作为序列聚类的参考标准
Step9：
以两种提取方法获得的scaffolds丰度构建坐标系，依据scaffolds的丰度进行Contig Binning聚类，Contig Binning的集合就代表了假定的某一微生物群落的基因组，其中圆圈的大小代表序列的长度，不同颜色代表单拷贝基因。由于不同的物种可能会有同一丰度的基因集合，因此Contig Binning的聚类结果还需进行Teltranucleotide频率的主成分分析，以区分不同物种
Step10：
从测序数据中筛选重复元件或多拷贝基因
Step11-12：
筛选所有的与Contig Binning聚类集合相关的reads，重新进行基因组de novo组装，获得一个标准的基因组草图。可根据保守的单拷贝基因对组装结果进行验证，明确组装或其他的基因组结构问题，并通过Cytoscape对重复序列和微生物多样性代表序列进行可视化
作者通过Contig Binning的分析方法，最终获得了31个细菌基因组，包括相对丰度在1%以下的物种基因组，并对31个细菌物种进行了门水平的分类。
图4 通过Contig Binning获得的31个细菌基因组
（
图片来源《Nature Biotechnology》
）
同样，Mohamed利用宏基因组数据，研究了红海海域8个位置的微生物群落，通过Contig Binning的序列聚类和分析，获得了136个微生物基因组(Mohamed
et al.
, 2016)。与Mads稍有不同的是，Mohamed主要将Teltranucleotide和序列相对丰度作为Contig Binning的聚类的参考指标，具体的分析策略如下：
图5 Mohamed在红海海域的取样位置及Contig Binning的分析策略
（
图片来源《Scientific Data》
）
对组装获得的136个微生物基因组，Mohamed分别进行了古菌和细菌的分类分析。对于古菌而言，作者依据122个单拷贝标记基因构建物种进化树；对于细菌而言，作者依据120个单拷贝标记基因进行物种分类分析，结果如下：
图6 Mohamed对组装的古菌和细菌构建物种进化树
（
图片来源 《Scientific Data》
）
由于Contig Binning的组装策略可以帮助科研工作者探索样品中难以培养的微生物群落，因此自从Contig Binning的组装策略问世以来，很多专家学者都陆陆续续对Contig Binning的组装方法展开了研究。
Microbiome期刊于2016年发表了一篇综述，认为Contig Binning的组装策略主要分为3类：
核酸组成（NC）
、
核酸组成与丰度（NCA）
、
积分丰度（DA）
等，然而各个方法都有各自的优缺点(Naseer Sangwan, 2016)。将核酸的组成与序列的丰度相结合被认为是一种比较好的策略，既能保证Contigs Binning的效果，也能相对节约计算资源。具体信息如下表所示：
表1 Contig Binning的组装策略
（图表来源《Microbiome》）
另外，这篇综述还汇总了用于Contig Binning组装的软件及其功能介绍，
其中MetaBAT就是Mohamed在《A catalogue of 136 microbial draftgenomes from Red Sea metagenomes》中使用的Contig Binning组装软件：
表2 Contig Binning的组装软件
（
图表来源《Microbiome》
）
同样的，该篇综述对Contig Binning的整体思路做了总结。细细品味，该篇综述所总结的思路其实与Mads在《Genome sequences of rare, unculturedbacteria obtained by differential coverage binning of multiple metagenomes》文章中所提倡的思路有不谋而合之处。
两种思路都提倡依据序列丰度和核苷酸组分分析（核苷酸频率、GC含量、必要的单拷贝基因）来进行Contig Binning的基因组组装。具体思路可参考下图：
图7 Contig Binning的整体思路
（
图片来源 《Microbiome》
）
需要值得注意的是，对于不同的研究，或者依据不同的样本量的大小，或者对于不同的样本类型，选择Contig Binning的组装策略都会有细微的差异。因此，我们在选择Contig Binning来组装无法培养的微生物基因组时也需谨慎。
参考文献：
[1] Jesse D. Aitken and Andrew T. Gewirt. Toward understanding and manipulating the microbiome to treat intestinal disease. 2013
[2] K Ray .Gut microbiota: married to our gut microbiota. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 2012
[3] Mads Albertsen et al. Genome sequences of rare, uncultured bacteria obtained by differential coverage binning of multiple metagenomes. Nature Biotechnology, 2012
[4] Mohamed et al. A catalogue of 136 microbial draft genomes from Red Sea metagenomes. Scientific Data, 2016
[5] Naseer Sangwan. Recovering complete and draft population genomes from metagenome datasets. Microbiome, 2016
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