今天讲的这篇文章有点意思，虽然是一篇m6A甲基化的研究，但却做成了夏老师有点看不懂的样子。这篇文章就是清华大学刘万里团队，发表在25.5分的Cell大子刊Immunity上的文章。这篇文章讲的是ASC（抗体分泌细胞）的B细胞中，IgG1的mRNA的聚腺苷酸化和m6A甲基化修饰，对于IgG1抗体产生的作用：
B细胞利用表面的BCR（B细胞抗原受体），来识别抗原并启动信号传导。而B细胞产生的IgH（免疫球蛋白重链）有mem IgH（膜结合）和sec IgH（分泌型）两种，但实际上这俩用的是同一个基因座，ASC中mem IgH通过APA（选择性聚腺苷酸化）可以转为sec IgH。他们想要分析的是Ig的mRNA，在3'UTR上的m6A甲基化修饰情况。首先他们是使用了B细胞细胞系，进行了RNA测序，结果发现，只有IgG这个亚类的mRNA具有3'UTR，而这些IgG的重链也即是Ighg的mRNA，在d3'UTR（远端的3'UTR）上都有m6A甲基化的富集。而这些Ighg的mRNA上d3'UTR的m6A甲基化，正好能被m6A甲基化Reader YTHDF1所识别。于是他们提出了第一个假设，假设Ighg的mRNA上d3'UTR的m6A甲基化对于IgG的表达有一定的影响（假设都是基于已有的研究，以及获得的信息，所提出的，可以证伪的命题，通过提出假设来进行进一步的验证，才能更好地推进课题，不清楚假设的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）：
那么既然Ighg的mRNA上d3'UTR的m6A甲基化，可能会影响到IgG的抗体反应，那么调控Ighg的m6A甲基化的YTHDF1，可能也就参与了这个影响的过程。于是他们对YTHDF1进行了敲减（这里对于YTHDF1的敲减，其实就是柯霍氏法则的反向遗传学应用，通过抑制m6A甲基化的Reader，来查看对于IgG所产生的影响，不清楚柯霍氏法则和反向遗传学的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》），结果发现，在没有特定病原体条件下的未免疫小鼠中，YTHDF1缺陷轻度下调IgG分泌：
而YTHDF1靶向的m6A甲基化区域，位于经典mem Ighg1的3'UTR上，并不会影响成熟的sec Ighg1。那也就是说，YTHDF1调控的IgG1的分泌，可能和m6A甲基化没关系。那这要怎么办呢？之前也说了ASC中mem IgH和sec IgH是同一个基因座，也就是这俩的转录本其实有大部分是共用的，而mem IgH通过APA可以转为sec IgH。于是他们测序以及构建文库，分析了ASC中的Ighg1的转录本，结果发现了一个之前没有识别的Ighg1 RNA形式的存在，这个未识别的Ighg1转录本在3'UTR的远端显示了m6A1939和2147两个甲基化位点：
那么是不是这两个m6A甲基化位点造成了Ighg的mRNA的表达影响呢？这里他们构建了一个CRISPR的工具，通过定位到1939和2147两个m6A甲基化位点，进行定向地去除m6A甲基化（这里通过CRISPR对于甲基化的清除，其实已经优于很大一部分m6A甲基化研究的文献了，通过定点的m6A甲基化清除，可以有效避免后期的肯定后件逻辑谬误，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《列文虎克读文献》、《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。结果发现在m6A1939位点擦除m6A修饰后，明显降低了Ighg1 mRNA的丰度。也就是说m6A1939位点，在体内和体外介导Ighg mRNA的稳定性，YTHDF1则通过结合m6A1939，增强了Ighg1 mRNA的半衰期：
而荧光定位也发现，Ighg1的转录本与YTHDF1蛋白，在细胞核中存在着共定位。YTHDF1主要在ASC的细胞核中，发挥协调Ighg1 mRNA稳定性的作用，从而影响IgG抗体产生：
ASC细胞产生IgG抗体，与SLE（系统性红斑狼疮）有一定的关系。所以他们接着就分析了SLE患者的测序数据，结果发现SLE患者的YTHDF1 mRNA表达高于正常组。而在IFN-K治疗后，患者的YTHDF1表达显著降低：
通过单细胞测序（下图的UMAP图就是单细胞测序的结果，就是通过不同的基因表达，形成多主成因分析，并进行降维，展示出不同的细胞亚群，不清楚的话，可以去看看《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》），他们也发现在B细胞亚群中，SLE患者的浆母细胞显着增加。YTHDF1在浆母细胞中的表达差异高于其他m6A相关基因。而在体外的SLE模型中使用YTHDF1的抑制剂后，降低了OVA特异性IgG抗体的滴度。也就是说，YTHDF1可以作为SLE治疗的潜在治疗靶点：
最后就形成了这样的示意图，形成sec Ighg的核定位剪接中间体Ighg，在d3′UTR带有m6A位点，这个位点被YTHDF1识别，并维持其mRNA的稳定性。在SLE患者中也有YTHDF1高表达的ASC亚群，会产生大量抗体。通过CRISPR定点清除Ighg的m6A甲基化，或抑制YTHDF1，都能降低IgG抗体的产量：
这篇文章虽然做的是m6A甲基化，看上去挺不出彩的一个课题。但他们从寻找Ighg1的不同转录本上的3'UTR位置上m6A甲基化位点，到使用CRISPR进行特异性的m6A甲基化清除，都做得相当到位。如果你正巧也在做m6A甲基化的课题，可以考虑看看这篇文章。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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