细胞囊泡结构与药物递送
在细胞中，关键的生化过程发生在由磷脂层包围的囊泡隔室内或囊泡膜上。这些隔室促进了孤立水腔内的专门活动，因此囊泡在细胞物质储存和信号运输中起着至关重要的作用，甚至在细胞器和细胞的形成中也是如此。天然囊泡由脂质层组成，脂质层可形成膜用于包裹内部物质，随后这些囊泡能够识别特定的膜并与之融合，以释放货物。然而，脂质膜所施加的限制，包括较差的渗透性和物理屏障，对生物制剂的包装和功能化构成了挑战。这些限制阻碍了它们在疾病治疗和货物运输中的有效应用。
与基于脂质和膜封闭的囊泡不同，没有膜的液滴状隔室是通过液-液相分离（LLPS）形成的，并通过生物分子之间的多价相互作用冷凝。这种无膜隔室被定义为凝聚层（coacervate），在生命的起源中起着至关重要的作用。之前的研究已经观察到细胞内的无膜细胞器，如卡哈尔小体、P颗粒和应激颗粒。随着最近的进展，这些无膜隔室作为递送平台变得非常可行，因为它们易于跨膜递送，有效地招募治疗药物，并保持有效载荷的生物活性。然而，由于聚结和解组装，LLPS组件在体外的动态结构特性往往无法满足长期储存和给药的要求。
液-液相分离组装而成的凝聚囊泡（Coacervate vesicles）
受这些现象的启发，
浙江大学
顾臻教授、李洪军研究员
和
中国医科大学
Funan Liu
等人
报告了一种由胆固醇修饰的DNA和组蛋白的液-液相分离形成的凝聚囊泡。与磷脂基的膜结合囊泡不同，凝聚囊泡表面没有膜结构，由高密度液体层和充水腔组成。通过一个简单的凝聚过程，作者证明了各种生物制剂，包括病毒颗粒、mRNA、细胞因子和肽，可以在液相中直接富集。与易于聚集的液滴状凝聚层相比，凝聚囊泡显示出优异的动力学稳定性，可成为生物制药的多功能递送载体。研究证实，将溶瘤病毒掺入这些凝聚囊泡中，可以赋予它们强大的溶瘤功效，并在小鼠模型中引发强有力的抗肿瘤免疫反应。
相关工作以“Coacervate vesicles assembled by liquid–liquid phase separation improve delivery of biopharmaceuticals”为题发表在
Nature Chemistry
。
【文章要点】
一、凝聚囊泡的制备
两亲物的界面自组装和辅助表面活性剂的内源性重构可用于稳定凝聚层并改变其界面张力。受天然囊泡隔室的启发，作者在这项研究中描述了一种基于核酸-蛋白质复合物的LLPS囊泡组装，其中用胆固醇修饰的单链DNA（ssDNA）Chol-ssDNA和组蛋白在特定组分比例水平处可发生自组装（图1）。具体而言，在真核细胞中，基因组DNA和核蛋白可以通过相分离介导压缩成无膜异染色质结构域。因此，作者应用组蛋白和Chol-ssDNA来确定它是否也可在体外经历相分离。通过系统研究，在不同比例和浓度的组蛋白和Chol-ssDNA下观察到了三种不同的相态，包括均相溶液（SOL）、凝聚液滴（COA）和以低密度腔为特征的凝聚囊泡（CV）。在组蛋白（0.025–2 mM）和Chol-ssDNA（0.1–50µM）的浓度范围内，它们的水溶液通过简单的混合过程自发形成了上述三种相态。其中，CV是在一定浓度（[组蛋白]≥0.25 mM，[Chol ssDNA]>1µM）和高组蛋白与Chol ssDNA比率（[组蛋白质]/[Chol ssDNA]>20）的条件下形成的。作者观察到，由Chol ssDNA-组蛋白层包围的核心是一个低密度相，在脱水后转化为空腔。此外，与传统脂质膜的几何各向异性相比，CV层中的分子分布相对均匀。
图1 用于生物药物递送的凝聚囊泡的构建
二、性能表征
研究表明，Chol-ssDNA的疏水性是CV组装中的一个驱动力，并且静电相互作用、疏水相互作用和氢键等这些弱和多价相互作用在LLPS过程中也起着重要作用（图2）。更重要的是，作者也证明了这种凝聚囊泡被高密度层包围，并且非常稳定。通过在LLPS过程中添加病毒（腺病毒血清型11，ad11）、双链DNA（dsDNA）、信使RNA、肽（LTX-315）和细胞因子（白细胞介素2、IL-2），作者进一步探索了凝聚相的募集能力。研究发现，CV对带负电荷的货物表现出强大的富集效率（ad11 76.99%，mRNA 83.5%），对带正电荷的货物的装载效率相对较低（LTX-315 10.15%）
图2 凝聚囊泡的物理化学性质
三、生物制剂和抗肿瘤性能
此外，凝聚囊泡可以在温和的条件下保持生物药物的生物活性，并可增强其在体外和体内的递送效果。具体而言，这种递送载体可以通过受体非依赖性和能量依赖性的巨胞饮吞噬过程，使溶瘤病毒（ad11）内化到肿瘤细胞中的效率提高48倍（图3）。在荷瘤小鼠模型中，作者证明凝聚囊泡可以促进溶瘤病毒的驻留和抗肿瘤免疫反应，从而缓解肿瘤生长并增强生物治疗的疗效。
图3 凝聚囊泡对溶瘤腺病毒的招募
【
结论与展望
】
在这项研究中，我们证明了通过DNA和核蛋白的LLPS形成凝聚囊泡，呈现了一种具有水腔的异质凝聚相的层次结构，并在各种生物药物募集中具有普遍性。人们一直致力于探索LLPS组装、拓扑结构、物理和化学特性以及细胞内递送途径的规则。在这方面，上述研究发现疏水性、电荷和基于静电效应的多价相互作用决定了相态，并且可作为凝聚的内在驱动力。同时，预测囊泡结构形成和空间分子分布的机制仍在研究中。值得注意的是，凝聚囊泡由于其制备简单和无害的水基系统，比其他囊泡载体具有优势。鉴于本研究中溶瘤病毒递送的可行性，未来的工作将旨在扩大递送的治疗药物的范围，以治疗各种疾病，如功能蛋白和遗传物质。与药物递送中的凝聚囊泡相关的另一个关键问题是如何设计物理化学触发相变的LLPS组装，这可以进一步实现生物制剂的精确和可控递送。此外，考虑到天然囊泡在有效载荷和信号运输或包装中的特异性，这种结构也可以被重塑以识别特定的靶细胞。例如，在LLPS载体表面掺入靶向分子可以为其他生物医学应用开辟可行性。作者期望球形、泡状和聚集的凝聚物之间的拓扑变换与生理活动有关，并可能为生物调节的蛋白质聚集疾病的治疗提供线索。
