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华东理工大学郑高伟教授课题组ACS Catalysis：多酶级联催化乳酸的从头合成

研之成理 · 公众号 · · 2024-03-26 11:38

正文

▲ 第一作者：丁旭伟

通讯作者：郑高伟

通讯单位：华东理工大学

论文DOI：10.1021/acscatal.3c05489

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本研究基于酶催化单元模块按需组合的多酶合成路线构建思路，建立了甲醇生产D-、L-和外消旋乳酸的多酶催化合成途径；通过优化单元酶催化模块和多酶系统，将乳酸产物浓度提高到2.2–2.8 g/L，最大合成速率达到9.6–15.6 g/L/天，乳酸光学纯度达到99%。

背景介绍

A. 生物固碳途径

在自然演化的过程中，自养微生物逐步演变出固定 CO ₂ 的途径，将其转化为有机生物质，例如卡尔文循环（占 90% ）、还原性 TCA 循环、 WL 途径等。然而，这些天然的固碳途径存在一些缺陷，如固碳途径长，效率低（受到高氧化态 CO ₂ 的限制，需要克服较高的能垒，使得羧化酶成为限速步骤）。随着合成生物学的发展，研究者逐步聚焦于人工固碳途径，主要包括改良天然固碳途径以提高固碳效率，以及设计全新的固碳途径。 2016 年， Erb 团队构建了第一条体外人工固碳途径（ CETCH 循环），共包含 17 个酶，实现了乙醛酸的从头合成，固碳效率达到 5 nmol CO ₂ /(min·mg) ，为构建人工固碳途径开辟了新的道路（ Science 2016, 354, 900–904 ）。 2021 年，马延和团队以 CO ₂ 和 H ₂ 为原料，设计了人工淀粉从头合成途径（ ASAP ），固碳效率达到 22 nmol C/(min·mg) ，比玉米中的淀粉合成速率高约 8.5 倍（ Science 2021, 373, 1523–1527 ）。这些突破为后续的研究人员提供了宝贵的参考。

B. 甲醛酶的创制

除了 CO ₂ 的直接固定外，对其还原衍生物（如甲酸和甲醇）的利用和转化以合成多碳化学品也至关重要。其中，甲醛酶（ FLS ）是一种苯甲醛裂解酶，首次通过蛋白质设计进行工程改造，用于直接连接 C1 单元酶催化剂（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 3704–3709 ）。 FLS 能将三分子甲醛缩合成一分子 DHA ，成为唯一已知的能够催化 C1 到 C3 转化的酶。由于 DHA 可通过磷酸化进入糖酵解途径成为最终产物，因此甲醛酶可以轻松地整合到代谢中，实现一生二，二生三，三生万物的理念。尽管相对于 CO ₂ 的固定，甲醛酶催化的缩合反应在热力学上更为有利，但其局限在于催化活性低，需要通过蛋白质工程大幅提高其活性。

C. 乳酸的合成方法

乳酸是我们最为熟悉的平台化合物之一。工业上约 90% 的乳酸是通过微生物发酵法生产的。然而，其原料主要依赖于糖类化合物和部分生物质。糖类物质（如葡萄糖）的持续供应存在不确定性，并且与我们竞争粮食的消费，可能引发潜在的粮食安全问题。生物质虽然可作为替代原料，但由于无法被微生物直接利用，其前处理也会带来一定成本负担。因此，迫切需要开发新的乳酸合成途径以解决这些问题。

研究出发点

鉴于先前的研究人员在人工固碳领域的杰出工作，我们也希望在此基础上进一步设计更多的固碳途径。我们选择乳酸作为目标分子，因其具有两种构型（ D- 乳酸和 L- 乳酸）。迄今为止，从 C1 原料到光学纯的乳酸生物合成途径尚未有报道。我们基于途径短、能量供应较少、采用纯酶法的原则，设计了三条非天然的 L- 、 D- 和外消旋乳酸的合成途径。途径中所有酶的基因序列是可获得的，以便于后续的分子学操作。最后，我们对途径进行了不同方面的优化，以尽可能提高整体的乳酸合成水平。

图文解析

A. 途径设计

甲醇到乳酸的合成路线

我们将整个合成路线划分为两个模块。模块一的底物是甲醇，可通过电化学催化从 CO ₂ 制备而来，经过 AOX 和 FLS 双酶催化得到产物 DHA 。这个模块也是构建 C1 原料的生物利用途径常用的模块。模块二则是从 DHA 出发，经过 3-4 步反应合成 D- 、 L- 和外消旋乳酸。关于模块二，起初设计了多种合成路线，考虑到路线长度、辅因子需求、手性控制、热力学以及催化剂的效率，最终选择了图中的路线。整体合成路线在热力学上是有利的，有助于推动级联反应的正向进行。

B. 元件组装

酶元件的筛选

在设计好合成路线的基础上，接下来是筛选对应步骤的酶元件。尽管一些反应步骤已经被报道，但我们仍然尽可能筛选更多的基因，旨在找到催化效率更高的元件，并为后续研究提供更多功能酶信息。其中，我们首次挖掘到在大肠杆菌中可溶性表达，并且对甲醇具有氧化活性的醇氧化酶AOX。我们对其进行了三轮定向进化，使其催化效率提高了5倍， k _cat 达到了10 s ^–1 。然而，总体而言，FLS和AOX仍然是限速性步骤。在后续工作中，我们将继续对它们进行分子改造，以进一步提高其催化效率。

C. 模块优化

模块二的组装和优化

除了通过蛋白质工程提高限速酶的效率外，我们还尝试进行反应工程的优化，以提高整条合成路线的整体合成水平。在模块一中，由于中间体甲醛的毒性，我们重点对催化剂的载量进行了优化，使得 DHA 的合成速率接近最快，从而减少体系内甲醛的积累。在模块二中，我们重点优化了涉及磷酸基团转移的反应步骤。根据之前的热力学计算结果显示，磷酸化和 ATP 再生循环相对于其他反应而言热力学上不利，因此成为限速步骤。通过文献调研，我们发现多聚磷酸和 Mg ²⁺ 的浓度对热力学平衡有影响。因此，我们对这两者的组合进行了细致的探究，筛选出了合适的反应条件，进一步提高了合成速率。综合而言，模块二能够实现 15 g/L 的合成水平。

D. 一锅合成

一锅两步法合成乳酸

在最终设计级联合成模式时，我们对各元件对甲醛的耐受性进行了表征，发现 DHAK 和 D-LDH 对甲醛的毒性影响较大。为了缓解甲醛的抑制作用，我们设计了一种一锅两步法的合成方法。在起始反应中，我们首先投入模块一进行反应，经过 3 小时后甲醛的积累减少，然后我们继续将模块二投入反应中，持续进行 3 小时。总体而言，人工乳酸合成途径能够达到 2.2–2.8 g/L 的合成水平。

总结与展望

从 C1 原料甲醇出发，我们设计了三条到 D- 、 L- 和外消旋乳酸的多酶催化合成途径。通过模块化的构建和过程强化，最终实现了 2.2–2.8 g/L 的乳酸合成水平，最大合成速率达到了 9.6-15.6 g/L/ 天，并且乳酸的光学纯度达到了 99% 。总体而言，该路线仍然受到模块一的限制，因此，通过蛋白质工程大幅提高 FLS 和 AOX 的催化活性将会是后续的重要工作。

心得与体会

虽然人工乳酸合成途径相比传统发酵法具有一些优势（如底物供应、途径简短、易于操控），但不可否认的是，以糖和生物质为原料的发酵法能够实现很高的滴度（百克每升）。因此，我们将在未来的工作中进一步优化合成路线，以降低成本、提高产率。因此，无论是人工乳酸的合成还是其他产品的从头（ C1 原料）合成，都处于一种 “ 理念 ” 状态，短期内难以实现。因此，需要更多的工程研究来实现从 “0 到

华东理工大学郑高伟教授课题组ACS Catalysis：多酶级联催化乳酸的从头合成

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