甘露特钠胶囊（GV-971）是2019年在中国附条件获批上市、用于治疗轻中度阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）的中国原创新药。GV-971上市后给中国AD患者带来具有临床价值的治疗获益。2019年中国科学院上海药物研究所耿美玉研究团队在Cell Research发表题为“Sodium oligomannate therapeutically remodels gut microbiota and suppresses gut bacterial amino acids-shaped neuroinflammation to inhibit Alzheimer’s disease progression”的文章（Cell Res. 2019 Oct;29(10):787-803），首次提出并揭示了GV-971通过调节肠道菌群、抑制外周炎症、减少中枢神经炎症、发挥治疗AD的作用机制。之后，美国华盛顿大学David Holtzman教授与芝加哥大学Sam Sisodia教授两个实验室背对背、独立验证了GV-971重塑肠道菌群、抑制神经炎症、改善认知功能障碍的作用特点，相关研究联合发表在2024年的Molecular Neurodegeneration (2024 Feb 17;19(1):18)上。尽管如此，GV-971具体通过调节哪些特定菌群、抑制哪些特定靶点及信号通路、进而抑制外周炎症和神经炎症、改善认知功能障碍的分子机制仍不十分清楚。
为了回答上述问题，耿美玉带领团队继续以5XFAD转基因小鼠模型为研究对象，发现富含Rib重复序列黏附蛋白基因的乳杆菌株（Ribhigh-L.m.）在AD病程进展中发挥了关键作用，该序列黏附蛋白在AD患者菌群中富集也得到验证。机制研究表明，毒力因子Rib蛋白通过介导Ribhigh-L.m.菌株与肠道上皮细胞黏附，引发代谢重编程，导致包括乳酸在内的大量代谢产物的增加。深入研究发现，过量的乳酸通过激活肠道上皮细胞GPR81-NF-kB轴线、刺激肠上皮产生血清淀粉样蛋白A（SAA），SAA则通过激活天然免疫细胞促进外周Th1等获得性免疫细胞活化。GV-971通过直接与Rib黏附蛋白的GIANLDKL氨基酸区域结合，阻断了Ribhigh-L.m菌株与肠道上皮细胞的黏附，纠正过量乳酸的积聚，抑制GPR81-NFkB介导的SAA的产生，最终缓解Th1细胞引起的炎症反应。相关研究于2024年11月19日，在Cell discovery期刊上以题为“Sodium oligomannate disrupts the adherence of Ribhigh bacteria to gut epithelia to block SAA-triggered Th1 inflammation in 5XFAD transgenic mouse”的研究论文形式在线发表，为深入理解GV-971靶向菌群的作用机制提供重要依据，为AD药物研发提供了全新设计理念。中国科学院上海药物研究所的王薪懿博士和谢作权博士为本文的并列第一作者，通讯作者为耿美玉研究员。
1. 5XFAD转基因小鼠的病程进展伴随肠道菌群组成和代谢途径改变及肠道炎症发生首先，研究人员发现，随着病程的进展，AD转基因小鼠肠道微生物的厚壁菌门和乳杆菌科的细菌显著增加，而拟杆菌门和鼠杆菌科细菌则显著减少(图1c)。使用宏基因组测序显示，与WT小鼠相比，在41周龄时，鼠乳杆菌（L.m.）的相对丰度在转基因小鼠中显著增加。乳杆菌属内的其他物种，如动物乳杆菌等也显示出类似增加趋势（图1d）。相反，41周龄的转基因小鼠表现出较低丰度的拟杆菌属CAG.927、普雷沃氏菌属CAG. 1031等（图1e）。进一步利用宏基因组学技术，分析了肠道微生物群代谢途径的改变17。与年龄匹配的WT小鼠相比，41周龄转基因小鼠的各种代谢途径发生了实质性改变，包括之前在36周龄转基因小鼠中发现的与苯丙氨酸相关的途径13（图1f）。从24到41周龄，与WT小鼠相比，转基因小鼠的糖酵解/糖异生、脂肪酸途径和苯丙氨酸代谢途径的显著失调（补充图S2a）。此外，转基因小鼠粪便的乳酸脱氢酶（LDH）——一种催化乳酸产生的酶——则显著上调（图1g）。重要的是，这些代谢途径的改变与已知的细菌物种的功能变化密切相关，即糖酵解/糖异生的增加与乳杆菌的增加密切相关18，而苯丙氨酸代谢的减少可能与拟杆菌的减少有关19, 20。使用非靶向代谢组学，发现41周龄转基因小鼠的粪便与WT小鼠相比，存在代谢物谱的明显差异（图1h），提示41周龄的转基因小鼠粪便发生了显著的代谢物重编程。随后，探讨了代谢紊乱是否能诱导肠道上皮炎症。对41周龄WT和转基因小鼠的回肠组织切片进行苏木精-伊红(HE)染色显示，转基因小鼠胃肠道内上皮完整性发生显著恶化，表现为肠道衬里的结构不规则、肠道水肿增加和肠道组织肿胀（图1i-k），受影响区域的免疫细胞浸润也显著增加（图1l）。以上结果表明AD转基因小鼠肠道存在持续的炎症免疫反应。2. 改变的肠道菌群诱导肠上皮分泌SAA，从而激活外周的先天性免疫反应和Th1偏向的炎症反应为了探究上述关联之间的因果联系，该研究对接受了41周龄转基因或WT小鼠粪便的受体小鼠新鲜分离的回肠组织进行了RNA测序，发现SAA显著上调（图2a,b）。SAA是一种与脂蛋白密切相互作用的载脂蛋白，包括高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）25-27。该研究进一步对接受41周龄转基因小鼠粪便的小鼠的回肠组织进行了免疫组织化学染色，结果表明，在接受转基因小鼠粪便的受体小鼠回肠组织绒毛尖端呈现出明显的SAA蛋白染色（图2c）。SAA通常被认为是急性期反应（APR）蛋白之一，主要参与炎症反应并激活单核细胞等先天免疫细胞31。研究团队发现，用人源SAA（hSAA）可以剂量依赖性地刺激人单核工具细胞（THP-1）中NF-kB信号的活化，提示THP-1细胞本身可以被SAA激活（补充图S4a）。暴露于hSAA后，包括IL-6和TNF-a在内的一大类细胞因子显著增加（图2d,补充图S4b）。值得注意的是，研究还观察到促进Th1细胞分化的两种细胞因子IL-12和IFN-γ显著增多（补充图S4c）。所有这些促使研究人员假设，SAA刺激的单核细胞可能可以直接诱导Th1细胞分化。为了验证这一假设，研究团队进行了一项共刺激实验，发现在没有THP-1共培养的情况下，SAA自身不能激活原始CD4+ T细胞分化为Th1细胞（补充图S4d），只有在共培养条件下，SAA刺激的THP1细胞才能显著增加Th1细胞数量（图2e）。此外，使用小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）得到了一致性结论。总的来说，小鼠SAA（mSAA）显著刺激了多种促炎细胞因子，包括DC和Th1诱导剂如RANTES、TNF-a、G-CSF、IL-6和IL-12p40，并同时减少了Th2诱导剂IL-4的产生（图2f）。随后，该研究发现，AD转基因小鼠的血浆中SAA水平和Th1细胞数量都显著高于WT小鼠（图2g-h），提示SAA可能参与了AD转基因小鼠中Th1偏好性炎症。进一步，移植AD转基因小鼠的粪便能使受体小鼠血液SAA水平增加， 同时引起单核细胞和Th1细胞数量的增加（图2i-k），提示SAA的增加确实可由失衡的肠道微生物群介导。3. 与野生型小鼠相比，从转基因小鼠分离的L.m.菌株表现出Rib高表达报道表明，菌群丰度的增加可以增强宿主-微生物相互作用。该相互作用是通过细菌黏附素介导实现的，细菌黏附素驱动细菌与宿主上皮细胞黏附、导致后续的下游效应32-35。由于黏附素可组成细菌毒力因子，该研究将宏基因组数据与毒力因子数据库（VFDB）进行比对，对41周龄转基因小鼠粪便样品中的候选毒力因子（VFs）进行鉴定。在众多高丰度的毒力因子中，只有包含YSIRK信号域/LPXTG锚定域表面蛋白和Rib/alpha/Esp表面抗原的假定表面黏附素的毒力因子在AD转基因小鼠粪便中显著上调，事实上，该黏附素被命名为Rib（即对蛋白酶具备抗性的免疫B组蛋白36）（图3a）。研究发现Rib的比例随着AD转基因小鼠疾病进展而显著增加，而WT小鼠则没有表现出这种相关性（补充图S5a）。随后的实验表明，用ABX消除转基因小鼠的肠道微生物群可显著降低粪便中Rib的水平（图3b）。相反，在FMT实验中，接受转基因粪便样品的小鼠表现出持续显著升高的Rib水平（图3c）。Rib是乳杆菌属已知的黏附分子36。为了探究Rib是否在结构于功能上与L.m.直接相关，研究团队采用了包括多组学测序、单菌株分离、功能测试等在内的综合方法（图3d）。使用特异性引物，利用PCR技术，从41周龄转基因小鼠粪便和WT小鼠粪便中分离出了各自的L.m.菌株，并随后对二者进行了多组学测序。研究发现，AD转基因小鼠来源的L.m.（Tg-L.m.）和WT来源的L.m.（WT-L.m.）之间存在明显的基因组差异，包括毒力因子数量、基因组岛数量、前噬菌体总长度和插入序列数量、碳水化合物活性酶(CAZyme)基因数量、次级代谢物生物合成基因簇（smBGCs）基因数量等。Tg-L.m.和WT-L.m中的Rib基因在基因长度、序列重复数量、染色体位置或链方向上都存在明显差异（补充表S3）。利用单菌转录组研究进一步发现，Tg L.m.和WT L.m.之间的整体基因表达存在显著差异。与预期一致，相较WT L.m.， Rib（CPS94_RS00440）在Tg L.m.中显著上调 （图3f）。进一步，对Tg L.m.中上调基因的功能富集分析揭示，与WT L.m.相比，多个代谢相关途径在Tg L.m.中高度参与，包括蛋白质翻译、酰胺生物合成过程以及大分子代谢和生物合成过程等 （图3g）。此外，该研究发现Tg L.m.菌株的自聚集能力显著强于WT L.m.（图3h），提示Tg L.m.菌株具有更强的黏附能力。所有前述发现证实，虽然WT-L.m.和Tg-L.m.属于同一L.m.属，但两者在功能上却有很大不同，二者基因组差异、基因表达和聚集表型的差异，提示AD转基因小鼠菌群和正常WT菌群分离得到的各自L.m.菌株之间潜在致病性的差异。两菌株之间的差异是否由转基因的遗传因素驱动仍需进一步研究。4. 高表达Rib的Tg L.m.菌株导致代谢改变、激活SAA、引发Th1偏好性炎症鉴于细菌与宿主相互作用在调节代谢物方面起着不可或缺的作用17, 39，该研究进一步想探索Ribhigh-L.m. 是否能通过与宿主作用引起代谢的改变。为了回答这个问题，研究团队开展了体外共培养和体内FMT实验（图4c）。首先是体外实验，研究者将HT29细胞，一种人肠道上皮细胞系模型40，与Ribhigh-L.m的培养基进行共培养。Ribhigh-L.m.与HT29细胞的共培养后，除了增加苯丙氨酸和异亮氨酸外13（补充图S5e-f），还能显著增加乳酸的含量（图4d）。进一步，将Ribhigh-L.m.移植到无菌（GF）小鼠中可显著增加GF小鼠肠道的乳酸水平 （图4e）。基于乳酸可以激活GPR81，而GPR81可以激活NF-kB信号41-43，以及，NF-kB可以在转录水水平上激活SAA44, 45的相关研究结果，研究团队进一步探索了乳酸是否可通过GPR81-NF-kB轴参与激活SAA。为了验证这一假设，他们使用乳酸处理HT29细胞42。结果显示，乳酸可导致HT29细胞胞内的GPR81、p-NF-kB p65和SAA的活化（图4f）。使用GPR81激动剂3-Cl-5-OHBA也可得到类似结果46（补充图S5g）。另一方面，使用siRNA对GPR81进行敲低可阻碍乳酸或另一种GPR81激动剂3-5-DHBA对SAA的诱导作用（图4g,补充图S5h）。将Ribhigh-L.m.菌株移植到受体小鼠中，发现Ribhigh-L.m.定植可以显著增加回肠上皮细胞中GPR81、p-NF-kB p65和SAA的水平（图4h-j）。不仅如此，Ribhigh-L.m.还可以显著诱导受体GF小鼠的血浆SAA和Th1细胞的增加（图4k-l）。这些结果一致性提示，Tg来源的Ribhigh-L.m.能够刺激SAA的产生，并在体内激活Th1细胞。5. AD患者体内Rib基因组丰度的升高与乳酸和SAA水平的增加相关 上述发现是否能够在AD患者中得到验证。为了回答这个问题，研究团队纳入了58名临床诊断的AD患者，并用24名健康人群作为对照（图5a）。宏基因组测序发现了9种含有Rib结构域的细菌物种。它们当中的大部分在AD患者的菌群要比健康人群的菌群更加丰富，尽管这些细菌的整体丰度相对较低（补充图S5i）。鉴于L.m.是小鼠独有的，再加上Rib是多种物种中常见的细菌黏附素47，研究团队随后聚焦Rib结构域而非特定细菌物种，来评估病人粪便样本中的Rib基因序列丰度。结果显示，相较健康人群，AD患者的菌群表现出相对较高的Rib丰度（图5b）,于此同时，AD患者的血液SAA水平显著高于健康人群（图5c）。为进一步确定因果关系，他们进一步探讨了含有较高Rib丰度的AD患者的粪便样本是否可以诱导肠道上皮SAA产生。结果显示，与接受Rib丰度较低的健康人群粪便组相比，接受Rib丰度较高的AD患者粪便移植的小鼠结肠，其SAA染色显著增加（图5d-e）。同样，在这些小鼠中，粪便乳酸水平也比健康人群显著升高（图5f）。总体来看，这些结果强化了Ribhigh细菌与AD患者肠道中SAA的产生以及粪便乳酸水平升高之间的因果联系，证明了AD患者菌群的Rib基因丰度升高且与乳酸和SAA水平增加相关。6. GV-971直接结合Rib的GIANLDKL结构域，以减少细菌对肠上皮的黏附之前研究证明，GV-971可以纠正肠道微生物群失衡以控制神经炎症，但GV-971如何重塑肠道微生物的机制尚不清楚。由于Rib属于一个大家族的L.m.黏附素，其可以识别肠道黏液（粘蛋白）中的末端唾液酸残基36, 48，因此，研究团队推断GV-971作为酸性寡糖，很可能竞争性干扰黏附素与唾液酸化的粘蛋白的互作，从而阻止细菌与宿主的黏附49-51。为了验证这一假设，研究团队首先使用AlphaFold2对在Ribhigh-L.m.细菌从头测序中鉴定出的所有Rib旁系蛋白的基因序列进行蛋白结构预测，然后以Rib_gene1738作为代表序列进行预测研究，发现该蛋白由许多围绕蛋白质的重复域构成，其三维结构与已知的来自乳杆菌的黏附性Rib结构域（“Rib Long”（PDB: 6S5Y, 6S5w））存在相似性（图6a）。进一步，他们基于研究中发现的其他Rib家族细菌蛋白建模片段的相似性（补充图S6a），最终确定使用GIANLDKL基序作为最佳的对接基序47， 并建立了1376种不同的GV-971配体构象。在此基础上，通过glide-docking算法，进一步确定了7种具备最佳得分的GV-971构象（补充图S6b）。基于这些构象和蛋白结构，他们使用虚拟分子对接探究GV-971与Rib蛋白的静态结合潜力，结果显示，GV-971与L.m.细菌Rib_gene1738蛋白的GIANLDKL之间存在稳定结合（图6b,n=2-6糖单位的GV-971）。深入分析发现，GV-971与L.m.细菌Rib_gene1738的GIANLDKL重复结合的分子力主要是氢键（图6c）。为了深入探究真实的水溶液状态下二者的结合潜力，他们使用分子动力学软件AMBER52进行深入研究，结果显示，在100 ns复合物轨迹计算中， GV-971的 5糖单元，可以很好地与Rib黏附结构域稳定结合，其RMSD的波动在1 Å范围内（图6d-e）。不仅如此，其他Rib蛋白（Rib_gene0115、Rib_gene1850、Rib_gene2116和Rib_gene2117）与GV-971不论是在静态还是动态模拟条件下都能进行稳定结合，尽管结合位点因Rib基因序列的不同而存在差异（补充图S6c-f）。采用表面等离子体共振（SPR），他们直接测量GV-971与Rib的结合亲和力，结果显示，GV-971能以浓度依赖的方式与芯片上的Rib发生结合，其KD值为10-5 M（图6f,右panel）。所有这些结果表明，GV-971可以直接结合Rib的GIANLDKL域，进而阻断Ribhigh细菌对肠道上皮的黏附。接下来，他们进一步考察了GV-971是否会影响Ribhigh-L.m.黏附到肠道上皮及后续生物学效应。特定浓度的GV-971能显著减了黏附到HT29细胞的Ribhigh-L.m.细菌数量（图6g）。相应地，GV-971以剂量依赖的方式降低了HT29细胞中GPR81表达，抑制p-NF-kB p65信号，并减少了SAA产生（图6h）。此外，GV-971可以显著降低HT29细胞在共培养实验中的苯丙氨酸和异亮氨酸水平，重复了之前的发现（补充图S7a-b）。进一步体内结果表明，GV-971处理后显著降低转基因小鼠中L.m.的丰度（图6i）。在接受AD转基因粪便的小鼠中，GV-971处理也可显著降低L.m.丰度（图6j）。同步，GV-971能够显著矫正AD转基因小鼠中过量的粪便乳酸水平，并降至与WT相当的程度（图6k），且可在接受AD转基因粪便的受体小鼠中表现出降低乳酸的趋势（图6l）。此外，GV-971处理后，能够明显抑制转基因小鼠回肠SAA的产生（图6m-n），且在FMT实验模型中观察到更显著的效果（图6n）。进一步，研究团队发现GV-971还可以显著降低血液的SAA水平 （图6o）和血液中Th1细胞的数量（图6p）。总之，GV-971能与Rib黏附蛋白发生直接结合，阻断Ribhigh-L.m.黏附到肠上皮细胞，通过纠正过量乳酸恢复了乳酸平衡，降低肠上皮SAA的产生，并最终缓解了SAA诱发的Th1相关炎症在AD中的作用。本研究在5XFAD的AD小鼠模型首次发现了先前未被认识到的SAA新的功能。SAA传统上被认为是肝脏在响应细菌刺激时产生的急性期反应蛋白，但最近的研究表明肠道上皮细胞也可以产生SAA，以响应节段丝状菌（SFB）或SFB的鞭毛蛋白诱导的STAT3激活58, 59。本研究的发现表明，肠道上皮细胞确实是SAA产生的来源之一，且可由乳酸感应信号触发。该发现增加了我们对SAA在慢性或复发性炎症环境中作用的理解，也为我们提供了其与AD发生发展系统性炎症的潜在联系。由于SAA可以与先天免疫细胞相互作用59, 60，本研究发现SAA可以激活先天免疫，并随后产生Th1倾向的免疫反应，这些研究均表明SAA在AD进展过程中可能在免疫调节中发挥作用。此外，慢性炎症期间SAA的失调可能归因于各种毒力因子、炎症因子和代谢物通路的协同影响，但具体的机制与因果关系值得未来布局探究。总的来说，这项工作拓展了我们对肠道菌群变化与AD的Th1倾向的促炎症作用之间关系的理解。当然，是否转基因小鼠中的转基因本身的遗传改变对微生物组组成产生影响依然值得探讨。本研究发现，Ribhigh细菌毒力因子是细菌黏附到肠道上皮细胞的主要介质之一，是介导AD特定阶段的代谢重编程发生的触发因素。GV-971通过特异性靶向Rib、阻断携带Rib的细菌黏附到肠道上皮细胞、进而减少肠道上皮细胞的炎症反应，抑制机体的外周炎症反应，这些结果为靶向肠道菌群的糖药物的研发提供了重要的依据。上海交通大学附属第六人民医院郭起浩主任、中国科学院上海药物研究所郑明月研究员、临港实验室蒋轶研究员、上海交通大学附属瑞金医院无锡分院王涛主任和中国科学院上海药物研究所刘佳为本研究提供了重要协助。该项目得到国家基金委创新群体、上海市科技重大专项、临港实验室专项等基金的支持。参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41421-024-00725-5
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