博士期间，有的人课题平平无奇，但有的课题却做得很复杂。要不是夏老师给你们开着上帝视角，还真是觉得费劲。今天要讲的这篇文章有点复杂，不是因为内容多复杂，而是他们把机制做得比较细致。今天要讲的这篇文章就是中山大学第一附属医院的博士生，发表在14.3分的Bone Res上的文章，他们做的是线粒体自噬与ISGylation（被ISG15,干扰素刺激基因15结合的蛋白修饰），挺有意思：
他们研究的是膝关节OA（骨关节炎），通过mRNA的测序，他们发现在膝关节OA的软骨受损区域，PARP12表达显著上调（这其实也是柯霍氏法则的验证，通过表达的相关性，提出了可能存在的功能相关性的假设，不熟悉柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。于是他们把研究重点，放在了这个PARP12上：
而在PHC（原代人软骨细胞）中，进行了PARP12表达的验证，通过IL1β诱导后，PHC细胞中，PARP12表达和p62表达明显上调，而LC3表达下调（LC3和p62大家应该都熟悉了，这个是和自噬体形成密切相关的，p62通过结合泛素化标记的蛋白，将物质带入自噬体内，不熟悉自噬的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列的自噬那几章看看）。也就是说炎症刺激上调了PHC细胞中PARP12的表达，但下调了自噬能力。PARP12的亚细胞结构定位，主要分布在细胞质中，并与p62 和线粒体标志共定位。于是他们假设PARP12的表达很可能与线粒体自噬，以及OA进展密切相关。
为了证明这一点，他们建立了MIA（碘乙酸单钠）诱导的大鼠OA模型，通过这样的体内模型，进行进一步的验证。通过诱导获得膝骨关节炎后，他们发现PARP12主要在大鼠OA软骨细胞和大鼠关节软骨中上调。与体外的PHC细胞的结果相似，PARP12的亚细胞结构定位，主要分布在细胞质中，并与p62 和线粒体标志共定位：
为了确定PARP12在OA过程中的具体功能，他们在PHC细胞中进行了PARP12的敲减。PARP12的敲低，显著上调了COL2A1、Bcl2/Bax和LC3B等（BCL2和Bax这俩都是和凋亡信号通路相关的，线粒体上的蛋白，所以后期他们会分析PARP12表达对于软骨细胞凋亡的影响，不熟悉凋亡信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的凋亡那几章），但同时下调了p62。对应的，他们也进行了PARP12的过表达，结果发现过表达后，软骨细胞凋亡增加。电镜结果则显示出，吞噬细胞线粒体的自噬溶酶体和自噬体水平，在PARP12敲低后上调，但在PARP12过表达后下调。也就是所说，PARP12抑制PHC细胞的线粒体自噬：
接着，为了分析PARP12具体的作用机制，他们通过免疫沉淀，分析与PARP12结合的蛋白。在互作的蛋白中，他们找到了与线粒体融合和线粒体自噬相关的MFN1/2，以及ISG15（干扰素刺激基因15），这个蛋白可以和泛素化以及SUMO化类似的功能，通过ISG连接酶结合蛋白病进行修饰，也就是ISGylation。他们发现敲除或过表达PARP12，的确可以影响线粒体的数量。于是他们假设我们提出 PARP12 敲低导致ISG15和MFN1/2的下调，而PINK1-Parkin的表达上调（这其实就是通过之前实验结果，得到的假设，进行了进一步的假设迭代，通过发现PARP12与MFN1/2的结合，假设PARP12与线粒体直接的关联性，并引申到了线粒体自噬相关的PINK1-Parkin的表达上，不清楚假设迭代的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》，不熟悉线粒体自噬的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列）：
那么ISG15在这之间又参与了什么样的作用呢？他们首先通过敲减ISG15分析其在OA中的功能，结果发现ISG15可以抑制OA中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。而在敲减了ISG15的细胞中，MFN1/2的SUMO化及泛素化，有了明显的增加。也就是说，ISG15很可能会抑制PHC中线粒体蛋白的泛素化和SUMO化。PARP12与ISG15的互作，促进了ISG15的表达。而ISG15的表达增强，则促进了MFN1/2的ISGylation，并抑制了其SUMO化和泛素化。而MFN1/2的ISGylation增强了其表达，从而抑制OA中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬：
PARP12的下游已经确定了，那是什么诱导了PARP12的转录表达呢？由于IL-1β可以激活PARP12的表达，他们又通过JASPAR数据库进行了进一步的分析，结果发现炎症相关的转录因子IRF1可能参与激活了PARP12的转录。他们通过敲减IRF1后过表达PARP12来分析了两者的上下游关联性，以此确定了IRF1抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬并促进软骨变性，而PARP12可以逆转这个过程（实际上这一系列的验证，并不严谨，由于这里的验证命题并没有明确地将IRF1激活PARP12作为验证的命题，而是分析了两者表达之间的关联性，这样就很容易犯肯定后件的逻辑谬误，课题也因此不够严谨。不熟悉命题的外延或内涵，以及肯定后件逻辑谬误的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
鉴于PARP12对PARP12于OA的影响，他们找出了一个PARP12抑制剂，试图通过药理学来阻止OA进展。而找到的这种PARP12抑制剂，XAV-939可以通过靶向PARP12，促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬并抑制软骨降解：
接着，他们通过大鼠中过表达PARP12，来分析了体内PARP12过表达，对于线粒体自噬预计软骨降解的影响：
最后就形成了这样的示意图，IRF1介导的PARP12上调，而PARP12通过基于ISG15的MFN1/2的ISGylation，减轻MFN1/2的泛素化和SUMO化，抑制PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬，从而促进软骨降解：
总的来说这篇文章研究的内容线拉得很长，从PARP12的上游IRF1，一直到MFN1/2的ISGylation以及下游的PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬。但在验证的过程中，其实还是有一些欠缺的，也就是并没有围绕着蛋白间的结合，或者转录因子与启动子的结合，来进行验证，这样就会造成肯定后件的逻辑谬误（文献验证过程中，严谨是比较重要的一个环节，而确定分析验证的命题则更为重要，通过这个环节，可以确定验证的方法及技术，否则就会产生一定的逻辑漏洞，比如这里的验证，可以通过突变PARP12与ISG15的结合位点来进行验证，突变PARP12启动子上IRF1结合位点来进行验证，这样就会更合理。不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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