【转录组与动物育种专题】基迪奥转录组测序助力水产领域—斑石鲷抗病鱼种培育初探

基迪奥生物 · 公众号 · · 2022-06-24 18:08

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转录调控专题又来了~本次是该系列的第四篇文章，在之前的文章中分别介绍了转录组在牛、绵羊、肉鸡育种研究中的应用。除了转录组单组学研究外，还可联合全基因组重测序、16S rDNA扩增子等关联分析，挖掘动物育种中的关键基因。今天给大家分享这篇文章是转录组在水产育种研究中的具体应用，探索斑石雕在感染MCV后引起的免疫过程。在分享文章时也会同步结合传统的转录组数据挖掘流程，看看作者是如何完成一些关键信息的挖掘。

话不多说，上文章~

题目： 转录组揭示斑石鲷感染巨噬病毒后脾脏表达差异
发表时间： 2022年6月
发表期刊： Aquaculture
影响因子： 4.242
合作单位： 黄海水产研究所

#研究背景#

巨噬细胞病毒（MCV）是水产养殖中常见的一种病毒病原体，不同鱼类对其表现出不同的易感性。斑石雕是常见鱼类中易感程度最高的宿主之一，感染后死亡率高达90%，这一现象直接制约了斑石雕的产业化发展。为培育出相关抗MCV鱼种，了解斑石雕对MCV感染的免疫反应机制是本文的研究重点。因此，本文旨在利用转录组测序技术分析并挖掘MCV感染后，斑石雕的免疫反应机制。

#实验设计#

#研究思路#

向20例斑石雕样本注射MCV菌株，以确定合适的合适的MCV剂量构建感染模型。之后向120例斑石雕中注入合适剂量的MCV病株，在感染MCV病毒0天、1天、4天、7天、10天后采集无症状的斑石雕脾脏样本，每组3个生物学重复，共15例样本。提取RNA后用于转录组测序。

qRT-PCR验证转录组测序结果。

#研究结果#

1. 借助差异分析获得基因在不同组样本中转录水平的差异表达

基于表达量的差异分析基本是所有转录组类文章中最为常见的分析条目，旨在初步筛选在不同样本或不同组样本中差异表达的基因，因为这些基因往往是生物为适应外界环境变化而发生的内在基因的调控作用，基因的调控过程反应在转录水平上即是转录本的差异表达。所以，差异分析是从几万个（或几千个）基因中筛选目标基因的第一步。可借助Deseq2或EdgeR软件完成，常用筛选阈值为 log ₂ (FC)≥1且FDR≤0.05，范围可根据实际情景再调整。对于有生物学重复的实验可选择Deseq2或者EdgeR，无生物学实验可使用EdgeR，具体两种方式的差异和适用场景可参考《转录组专题-关于差异分析相关问题解答》详细了解。

文章通过表型观测发现感染MCV3天后，斑石雕游动速度减慢，身体相对发黑，在第4天时出现部分死亡，第7天死亡数目达到高峰，第10天时逐步下降。15个样本转录组测序共获得23365个基因，比对参考基因组后共获得2475个新基因，以及24004个基因序列存在可变剪切事件。以0天样本为对照组，经差异分析，在感染后1天样本中获得4571个差异表达基因；在感染后4天样本中获得4017个差异表达基因；在感染后7天样本中获得7089个差异表达基因；在感染后10天样本中获得5461个差异表达基因。相比于感染1-4天的样本，7、10天中差异基因数目更多。

图1 A不同组样本中检测出的共有基因和特有基因数目韦恩图；B：以0天样本为对照，在其他组中差异表达基因柱状图

2. 差异基因富集分析，定位响应MCV感染的相关途径和通路

既然说差异分析是筛选目标基因的第一步，之后则是对差异基因再次归类，进一步缩小筛选的范围，这一步借助功能富集分析完成。功能富集分析是指利用超几何检验判断特定基因集中（可以为差异基因集）富集到某个通路中的基因数目占特定基因集中基因数目的比例是否显著大于背景基因集中富集到该通路的基因数目占背景基因集中基因数目的比例，如果计算出的P值/FDR值≤0.05，则判定为该通路是显著富集的，可重点关注。

举个例子：如下图当中背景基因为测序得到的基因，

①假设有10000个，经过KEGG数据库注释，发现有50个基因在通路A中，则富集到A通路中的基因占比为5%；

②经过差异分析阈值筛选后，获得200个差异基因，同样经过注释后有40个差异基因在A通路中，则富集到A通路中的差异基因占全部差异基因的20%；

③借助超几何检验，判断20%是否显著大于5%。若得到的FDR≤0.05，则通路是显著富集的，说明该通路中的基因对外界的响应最为明显，对生物适应环境变化起到重要作用。

文章中，为综合筛选MCV感染后引起的斑石雕免疫应答过程，作者使用KEGG和GO数据库对每个比较组获得的差异基因注释并开展富集分析，发现NOD样受体信号通路、造血细胞系、细胞质DNA感应通路在所有比较组中均显著富集。B细胞受体信号通路、IgA肠道免疫网络、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、NF-kappa B信号通路主要在第4天和第10天显著富集。在1天、4天样本中主要富集的通路暗示其为MCV感染早期免疫过程。从富集到的通路中随机挑选7个基因进行qRT-PCR实验，其表达趋势与转录组检测结果一致。基本表现出在第1天时上调表达，第4天保持不变，第7天和第10天时再次显著增加。

图2 KEGG富集分析。红绿渐变表示通路的显著性，颜色越红表示富集程度越高

图3 显著富集的免疫通路中部分基因的qRT-PCR检测结果

3. WGCNA分析整体探索基因间的相互关联

Weighted gene co-expression network analysis（权重基因共表达网络分析，WGCNA）可利用基因表达量计算基因与基因之间的相关系数，以网络的形式更“真实”的展示生物体中基因间的互作关联，同时还可根据基因的连通性判断网络中的Hub基因。便于筛选与目标基因有关的其他候选基因或与某一性状或组织类型有关的基因。关于WGCNA的详细介绍可查看《WGCNA原理与分析—挖掘大样本中的关键基因》《大样本分析神奇WGCNA正式上线》。

借助WGCNA分析，作者将19078个基因划分到14个模块中，其中蓝绿色颜色的模块中免疫相关基因最多，且大部分基因在病毒感染后第1天表达量即出现变化。对模块中的基因进行KEGG富集分析，发现主要富集的通路为人类疾病、遗传信息处理等过程。对蓝绿色模块中的基因进一步构建核心基因网络图，图中包含的基因主要富集在“补体和凝血级联”、“代谢途径”中。

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