基于网络药理学方法分析落新妇苷干预骨关节炎的作用机制及实验验证

摘要 ： 目的 通过网络药理学预测落新妇苷治疗骨关节炎的潜在机制，并通过实验进行验证。 方法 从 PubChem 获得落新妇苷分子化学式 C ₂₁ H ₂₂ O ₁₁ ，通过 PharmMapper 和 Swiss Target 数据库筛选出与落新妇苷相关的靶点；在 GeneCards 、 TTD 、 Disease Gene Search Engine 3 个数据库筛选出与骨关节炎疾病密切相关的靶点基因；将落新妇苷 - 靶点基因和骨关节炎 - 靶点基因的网络合并，筛选出共同作用靶点，导入 String 数据库，导入 Cytoscape 进行可视化分析；将靶点基因上传到 DAVID （ https ： //david.ncifcrf.gov/ ）进行基因功能和 KEGG 通路富集分析。建立白细胞介素（ IL ） -1β 诱导的人软骨细胞模型，造模同时给予落新妇苷低、高质量浓度（ 12.5 、 25.0 μg/mL ）干预， CCK8 法检测药物干预 1 、 2 、 3 d 软骨细胞活性； Westernblotting 法和实时荧光定量 RCR 法检测药物干预 24 h 后肿瘤坏死因子（ TNF ） -α 和 G1/S- 特异性周期蛋白 -D1 （ CCND1 ）蛋白和 mRNA 表达。 结果 通过挖掘数据获得 377 个与落新妇苷相关的潜在靶点和 2 758 个骨关节炎的潜在基因；对网络进行对接，获得 43 个潜在靶基因，随后构建 PPI 网络；关键基因为 TNF 、癌基因同源物（ HRAS ）、肿瘤标志物热休克蛋白 90α （ HSP90AAS ）、淀粉样蛋白前体蛋白（ APP ）和 CCND1 ；关键通路为 AGE/RAGE 信号通路、肿瘤聚糖信号通路、 MAPK 信号通路、 P13K-AKT 信号通路、细胞增殖、凋亡等。与模型组比较，落新妇苷低、高质量浓度组人软骨细胞吸光度（ A _{450 nm} ）值均显著升高，差异有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）， TNF-α 蛋白和 mRNA 表达均显著降低（ P ＜ 0.05 ）， CCND1 蛋白和 mRNA 表达均显著升高（ P ＜ 0.05 ）。 结论 落新妇苷可能通过直接作用于 STAT1 、 STAT3 、 RAS 等靶点，干预 AGE/RAGE 通路，从而调节 TNF-α 和 CCND1 的表达，进而促进软骨细胞的增殖和抑制炎症因子的产生。

骨关节炎（ Osteoarthritis ， OA ）是一种退行性疾病，发病以老年人为主，是导致残疾的几大原因之一 ^{［ 1 ］} 。关节软骨的进行性退化引起骨与骨之间的摩擦，导致严重的疼痛、僵硬和残疾，炎症和分解代谢的改变与 OA 的发生和发展关系密切 ^{［ 2 ］} 。炎症介质的下调对 OA 的进展具有减缓作用，目前虽然在该病的相关发病机制研究方面取得了一定突破，但治疗方案仍然不足。相对于其他炎症性关节疾病，目前还没有有效的药物治疗 OA ，非甾体类抗炎药（ NSAIDs ）在临床上广泛使用，但仅能暂时缓解 OA 症状，而且会增加心肌梗死的风险 ^{［ 3 ］} 。中医药在退行性疾病中具有较为理想的疗效，可以提高患者关节活动和降低疼痛 ^{［ 4 ］} 。

落新妇苷最早从植物落新妇的根茎中分离获取，是一种天然的类黄酮化合物，因其多种药理特性而被广泛应用 ^{［ 5 ］} 。有报道指出，落新妇苷具有多种生物活性，可以用于抗肝纤维化 ^{［ 6 ］} 、抗氧化 ^{［ 7 ］} 、抗糖尿病肾病 ^{［ 8 ］} 、抗炎 ^{［ 9 ］} 等。此外，还有研究表明落新妇苷可以通过 NF-κB 信号通路抑制骨髓分化因子 88 （ MyD88 ）、 p65 和 κB 激酶 β （ IKKβ ），从而治疗慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎 ^{［ 10 ］} 。落新妇苷被证实不具有遗传毒性，进一步表明了其在临床应用中的巨大价值，然而，其治疗 OA 的作用机制尚未完全阐明。本研究基于白细胞介素（ IL ） -1β 诱导的软骨细胞模型，运用网络药理学和细胞实验验证相结合的方法，为深入探讨落新妇苷抗 OA 的作用机制提供新思路和新方法。

1 材料

1.1 主要试剂

落新妇苷（批号 BCTG-0233 ，质量分数 ≥ 98% ）和二甲基亚砜（ DMSO ，质量分数 98% ），均购自大连美伦生物科技有限公司。 DMEM 培养基、胰蛋白酶、链霉素、青霉素（美国 Promega 公司）；胎牛血清（ FBS ）和胶原酶 II （ Gibco 公司）、兔 IL-1β 粉剂（美国 Sigma 公司）； Trizol （ Invitrogen ， Carlsbad ， California ）； iScript ^TM cDNASynthesisKit 逆转录试剂盒（ BioRadLaboratories ， Hercules ， CA ）；肿瘤坏死因子（ TNF ） -α 、 G1/S- 特异性周期蛋白 -D1 （ CCND1 ）及 GAPDH 引物（美国 Sigma 公司）； RIPA 裂解溶液（碧云天生物技术研究所）； BCA 蛋白定量测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗 CyclinD1 、兔抗 TNF-α 、 GAPDH （ Addgene ，美国）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 二抗（ CellSignaling ）。

1.2 实验细胞

人软骨细胞来源于人软骨组织，人体软骨样本取自本院骨科接受全膝关节置换手术的 OA 患者，均经患者知情同意。组织收集根据本院医学伦理委员会的规定，并遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则。

2 方法

2.1 网络药理学

2.1.1 落新妇苷作用靶点查询 通过 PubChem 服务器（ https ： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）进行检索，输入关键词 “Astilbin” ，下载落新妇苷对应的化学式、 3D 结构以及 SDF 格式文件 ^{［ 11 ］} 。通过反向药效团匹配 PharmMapper 数据库（ http ： //59.78.98.102/pharmmapper/get.php ），上传落新妇苷的 SDF 格式文件，点击 Upload ，按照软件设定配体空腔要求选择 Pharmacophore ModelsWhose Pkd ≥ 6.0 ，查询出与落新妇苷有关靶点，根据匹配度 fit score 由高到低排序所有靶点；通过 Swiss Target 数据库（ http ： //www.swisstargetprediction.ch ），输入落新妇苷化学式，获得相关的潜在靶点，将得到的对应靶点信息进行汇总。采用 Uniprot 数据库（ http ： //www.uniprot.org/ ）对的靶点进行搜索，限定物种为人，对靶点名称进行规范校正，校正为官方名称。

2.1.2 骨关节炎靶点映射 登陆 GeneCards （ https ： //www.genecards.org/ ）、 Therapeutic Target Database 数据库（ TTD ， http ： //bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/ ）和 Disease Gene Search Engine 数据库（ http ： //210.107.182.61/geneSearch/ ）输入骨关节炎搜索已报道的与此相关的靶点，进行检索及筛选，删除重复的靶点，获得与 OA 相关的靶点，并与落新妇苷相关靶点之间进行匹配。

2.1.3 网络合并及基因富集分析 将落新妇苷和 OA 相关靶点的匹配后，获得落新妇苷 - 骨关节炎出共同靶点基因，导入 String 数据库（ https ： //string-db.org/ ）分析检索已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用关系，获取蛋白作用关系网络，使用 Cytoscape3.6.1 软件构建蛋白互作网络（ PPI ）。将这些基因上传到 DAVID （ https ： //david.ncifcrf.gov/ ）进行基因（ Gene Ontology ， GO ）功能和 KEGG （ Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes ）通路富集分析，进一步说明落新妇苷在治疗骨关节炎方面的潜在机制。

2.2 细胞实验验证

2.2.1 细胞培养与处理 人体软骨样本取自本院骨科接受全膝关节置换手术的 OA 患者，获得软骨组织后剪碎，用 0.25% 胰蛋白酶消化 30 min 。将组织置于含抗生素的胶原酶 II （ 2 mg/mL ） DMEM 溶液中，在 37 ℃ 下进一步消化 6 h ，收集上清液分别置于 10 mL 离心管中， 1 000 r/min 离心 5 min （离心半径 10 cm ），去除离心后的上清液，加入 DMEM （含有 10% FBS 、 100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素），在 37 ℃ 、含 5% CO ₂ 的细胞培养箱中培养。选取第 1 ～ 3 代的细胞进行后续实验。

2.2.2 CCK8 法检测落新妇苷对人软骨细胞活性的影响 取第 3 代软骨细胞，以 1 × 10 ⁴ / 孔的密度接种于 96 孔板中，培养 24 h 后分为 4 组：对照组、模型组和落新妇苷低、高质量浓度（ 12.5 、 25.0 μg/mL ）组，每组 6 孔。对照组加入 DMEM 培养液，模型组加入含有 10μg/mL IL-1β 的 DMEM 培养基，落新妇苷低、高质量浓度组加入含有 10 μg/mL IL-1β 和相应质量浓度落新妇苷的 DMEM 培养基。放入培养箱中继续培养，分别于给药后 0 、 1 、 2 、 3 d 取出 1 块培养板进行检测，每孔加入 CCK8 试剂 10 μL 。采用酶标仪检测软骨细胞的吸光度（ A _{450 nm} ）值。

2.2.3 Western blotting 法检测 TNF-α 和 CCND1 蛋白表达 取软骨细胞接种于 6 孔板，分组及给药同 “2.2.2” 项，孵育 24 h 后，将各组细胞放于冰上用 RIPA 裂解 30 min ，离心取上清液，根据 BCA 蛋白定量结果上样。加入 10% 的十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）处理 2 h ，转膜后加入 5% 脱脂奶粉室温封闭 1 h ，洗膜后加入内参抗体 GAPDH 、一抗 TNF-α 和 CCND1 抗体 4 ℃ 孵育过夜。 TBST 缓冲液洗 3 次，洗膜后用辣根过氧化物酶标记的二抗（ 1∶5 000 ）孵育 1 h ，洗膜后 ECL 化学发光显色，采用 Image J 软件对相关蛋白表达进行分析。

2.2.4 实时荧光定量 PCR （ qRT-PCR ）检测 细胞接种及分组给药同 “2.2.3” 项，孵育 24 h 后，采用 Trizol 法提取各组细胞的总 RNA ，逆转录酶转录为 cDNA ，以此 cDNA 为模板，按三步法行 qRT-PCR 扩增，采用 GAPDH 基因作为内源性参照物，检测 TNF-α 和 CCND1 的 mRNA 在各组细胞中的表达量。采用 2 ^{-△△ C t} 法计算目标基因的相对表达量，引物列见表 1 。

表 1 引物序列

Table 1 Primer sequence

2.3 数据分析

采用 SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，定量资料以 ± s 表示，多组比较先采用方差分析，然后采用 q 检验进行两两比较。

3 结果

3.1 落新妇苷和骨关节炎作用靶点查询

从 PubChem 获得落新妇苷分子化学式 C ₂₁ H ₂₂ O ₁₁ 。通过 PharmMapper 和 Swiss Target 数据库筛选出与落新妇苷相关的靶点 385 个，使用 UniProt 数据库中的 UniproKB 工具进行更正后，去除与人类无关以及无对应关系或者重复的靶点后，共筛选出包括 eapA 、 dhaK 、 avrPph3 、 CSDE1 在内的 377 个潜在靶点。在 GeneCards 、 TTD 、 Disease Gene Search Engine 3 个常用数据库筛选出与骨关节炎疾病密切相关的靶点基因，剔除重复基因后共得到 2 758 个基因。结果说明引起骨关节炎因素众多且发病机制复杂。

3.2 合并构建 PPI 网络

将落新妇苷 - 靶点基因和骨关节炎 - 靶点基因的网络合并，筛选出共同作用靶点基因 43 个。将 43 个靶点，导入 String 数据库，将相互作用靶点的结果导入 Cytoscape 进行可视化分析，得到由 43 个节点、 152 条边组成的网络，网络密度为 0.588 ，平均节点度为 6.08 ，当网络密度大于 0.5 及平均节点度大于 3 时，网络具有较好的关联性，点与点之间连接紧密，见图 1 。由网络可知，自由度较大的前 5 位靶点是肿瘤坏死因子（ TNF ）、癌基因同源物（ HRAS ）、肿瘤标志物热休克蛋白 90α （ HSP90AAS ）、淀粉样蛋白前体蛋白（ APP ）和 G1/S- 特异性周期蛋白 -D1 （ CCND1 ）。相关基因靶点集中在炎症、凋亡和增殖通路上，结果见图 2 。

3.3 基因富集及通路分析

富集的 GO 分析分为生物过程（ BP ）、细胞成分（ CC ）和分子功能（ MF ） 3 部分。 GO 分析结果表明， BP 分析显示细胞对药物的反应、细胞增殖与凋亡的正负调控、细胞死亡、磷酸化、磷代谢过程、催化活性的正调控、高分子代谢过程的正调控。其中，细胞的增殖与凋亡与骨关节炎的发病具有相关性，而细胞的磷酸化调节和控制蛋白质活力和功能。 CC 主要富集于细胞外区域、细胞质膜。 MF 分析显示与基因和蛋白质结合有关，同时可以影响金属内肽酶活性和蛋白质活性。结果见图 3 。经过 KEGG 通路富集后显示，落新妇苷参与多条信号通路， P ＜ 0.05 的信号通路共有 49 条，其中参与调控骨关节炎的信号通路有 AGE/RAGE 信号通路、肿瘤聚糖信号通路、 MAPK 信号通路、 P13K-AKT 信号通路、细胞增殖、凋亡等相关通路，见图 4 。其中 AGE/RAGE 信号通路与骨关节炎密切相关，因此综合网络药理学与文献调研结果，初步推测落新妇苷可能通过调节 AGE/RAGE 信号通路治疗骨关节炎，进一步设计细胞实验验证落新妇苷药理作用。

3.4 落新妇苷对软骨细胞增殖的影响

如图 5 所示，干预 1 、 2 及 3 d ，与对照组比较，模型组细胞 A _{450 nm} 值显著降低，差异有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）；与模型组比较，落新妇苷低、高质量浓度组 A _{450 nm} 值均显著升高，差异有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）。与落新妇苷高质量浓度组比较，低质量浓度细胞 A _{450 nm} 值显著升高，差异有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）。在本实验中落新妇苷 12.5 μg/mL 组比 25.0 μg/mL 组对软骨细胞的促增殖作用明显，软骨细胞的增殖能力与落新妇苷浓度的关系尚需探讨，但与时间成正相关。

3.5 落新妇苷对软骨细胞 TNF-α 和 CCND1 蛋白表达的影响

Western blotting 检测显示，与对照组比较，模型组 TNF-α 蛋白表达显著升高， CCND1 蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）。与模型组比较，落新妇苷低、高质量浓度组 TNF-α 蛋白表达均显著降低， CCND1 蛋白表达均显著升高，差异均有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）。与落新妇苷高质量浓度组比较，低质量浓度组 TNF-α 蛋白表达显著降低， CCND1 蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）。结果见图 6 。

3.6 落新妇苷对软骨细胞 TNF-α 和 CCND1 的 mRNA 表达的影响

qRT-PCR 结果显示，与对照组比较，模型组 TNF-α mRNA 表达显著升高， CCND1 mRNA 表达显著降低，差异均有统计学意义（ P ＜ 0.05 ）。与模型组比较，落新妇苷低、高剂量组 TNF-α mRNA 表达均显著降低， CCND1 mRNA 表达均显著升高，差异均有统计学意义（