ACS Nano丨香港中文大学唐本忠等团队合作制备NIR-II可激发吡啶探针用于γ-谷氨酰转肽酶和癌症检测

iNature · 公众号 · · 2024-08-05 11:03

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近红外（NIR）荧光探针检测γ-谷氨酰转肽酶（GGT）活性是癌症早期诊断的有效方法。虽然NIR吡啶探针在生化分析中表现良好，但是探针和亲本荧光染料在生物环境中的聚集容易导致低信噪比（SBR）,从而影响其临床应用。

2024年7月26日，香港科技大学/ 香港中文大学唐本忠和澳门大学 Liu Tzu-Ming、徐昌活共同通讯在 ACS Nano 在线发表题为 “ A Near-Infrared-II Excitable Pyridinium Probe with 1000-Fold ON/OFF Ratio for γ‑Glutamyltranspeptidase and Cancer Detection ” 的研究论文。 该研究开发了一种GGT可活化的聚集探针OTBP-G，1040 nm激发下能够在各种生物环境中实现双光子荧光成像。

通过调控亲水性和供体-受体强度，作者实现了扭曲的分子内电荷转移和系统间交叉过程之间的协同效应，并在激活前实现了OTBP-G的完美暗态。 酶促反应后，亲本荧光染料在670 nm处表现出明亮聚集诱导发射峰。 荧光染料转化为探针可以诱导1000倍的荧光开/关比，实现SBR > 900的体外GGT检测。 OTBP-G在体内1分钟内即可激活，在小鼠耳血管中的SBR>400。OTBP-G可通过局部喷雾进一步实现乳腺癌肺转移的早期检测，其效果优于临床标准的苏木精和伊红染色。作者期待对OTBP-G的深入研究能够推动癌症早期诊断和肿瘤相关生理研究的发展。 此外，该研究强调了亲水性和供体-受体强度在TICT探针最大化的开/关比中的关键作用，并展示了OTBP作为活性传感多功能平台的潜力。

癌症的早期诊断在临床肿瘤学中至关重要。即使是微小的癌症转移灶（2至3 mm）也可能对人类健康造成致命威胁。然而，目前的生物医学成像技术存在灵敏度低、空间分辨率差等问题，很难实现早期诊断。常用的正电子发射断层扫描和计算机断层扫描几乎无法检测到直径小于1cm的肿瘤。作为一种重要的癌症相关酶，γ-谷氨酰转肽酶（GGT）引起了人们的特别关注。GGT在维持细胞氧化还原代谢稳态方面起着至关重要的作用，在各种癌细胞的细胞膜上高表达，促进肿瘤进展、侵袭及耐药性等。因此，准确检测GGT可以大大提高肿瘤诊断的效率。

目前临床上检测GGT的方法是比色法检测试剂盒，GGT能将谷氨酰对硝基苯胺中的γ-谷氨酰基转移到N-甘氨酰甘氨酸上，生成对-硝基苯胺（Sigma-Aldrich，λ _ab =405nm）。基于比色法的酶联免疫吸附测定技术也可检测GGT活性，且特异性更好（MyBioSource，λ _ab =450nm）。但比色法样品处理过程复杂，不能直接检测生物环境中的GGT活性。具备开启特性的活性荧光探针在光学检测方面具有高时空分辨率、高灵敏度、非电离辐射安全等优势。除了商业化的荧光检测试剂盒（Sigma-Aldrich，λ _ex =365nm，λ _ex =460nm）外，近年来，已开发出多种可激活的荧光探针用于检测和成像肿瘤细胞和活体动物中的GGT。

然而，由于背景噪音大或亮度不理想，其实际临床应用仍然受到低信号背景比（SBR）的阻碍。研究人员已经开发出多种策略来提高成像质量。一种被广泛接受的方法是将对比荧光染料的激发波长红移。 第二近红外（NIR-II,1000-1700nm）激发可提供最小的自发荧光和背景信号。 最近的研究表明，通过将激发波长红移到NIR-II区域，能够显著增强组织穿透深度和成像分辨率。最广泛使用NIR（650-1700nm）激发的成像模式是双光子荧光（2PF）成像，其通过荧光染料同时吸收两个低能光子，有效地红移激发波长。 部分研究人员开发了用于GGT检测的2PF探头，但均未探索使用NIR-II激发来提高成像质量。

图1 AIE 荧光染料的表征 （摘自 ACS Nano ）

另一方面，NIR-II激发不一定增强SBR。由于不可避免的大共轭和高疏水性，当应用于生理环境时，NIR-II可激发荧光染料倾向于形成聚集体。聚集过程会导致聚集引起的淬灭效应，其中π共轭荧光团会失去发出荧光的能力。如果荧光染料的荧光跃迁无法保持，其相应的探针就不可能实现理想的开启过程 。开发能够进行聚集诱导发射（AIE）的发光材料为解决淬灭问题奠定了基础。 一般而言，由于分子内运动的限制，AIE发光体（AIEgens）在聚集状态下具有高发射性。除了强荧光，疏水性AIEgens形成的有机聚集体可以克服细胞扩散，为长期跟踪提供持久稳定的荧光信号。最近的研究已经报道了一些用于脑部脉管系统高分辨率成像的NIR-II双光子可激发AIEgens。 因此，NIR-II可激发AIEgens是用于设计高SBR肿瘤成像开启探针的潜在荧光染料。

AIE策略使得聚集态的明亮荧光染料成为可能。 另一方面，仍需要为最终的探针创建一个理想的暗态，以实现开启过程。 扭曲的分子内电荷转移（TICT）是各种商业探针中常用的暗态，包括硫黄素T（淀粉样β肽）、SYBR Green I（DNA）和Spinach aptamer（RNA）。强供体-受体（DA）相互作用、极性环境和足够的分子扭曲空间是TICT成功发生的三个先决条件。

因此，D-A强度足够高的亲水分子具有潜在的TICT活性。吡啶和喹啉结构是TICT分子常用的受体。 当构建这些具有带电结构的可激活探针时，如果移除头部引发电子级联消除反应，产生相应的中性荧光染料，则可通过削弱TICT效应激活荧光。不幸的是，许多情况下探针从其母体荧光染料中继承疏水性，形成聚集体导致严重的分子间相互作用，从而阻碍TICT过程。事实上，许多具有吡啶和喹啉结构的TICT分子在生物环境中也是明亮的AIEgens，难以实现基于活性的响应性开启。因此，需要采取其他策略来实现吡啶和喹啉探针的完美暗态。

图2 使用OTBP-G进行原位和转移性肿瘤成像 （摘自 ACS Nano ）

通过增强TICT效应，可以有效地实现暗态工程。与常用的电子给体二苯胺（DPA）相比，甲氧基取代的DPA具有较强的供电子能力和亲水性。研究表明，甲氧基团能有效地诱导AIEgens进入暗态。因此，该研究以甲氧基DPA为电子供体，吡啶为电子受体，合成了两个GGT响应探针OTBP-G和ODBP-G。两个探针的化学结构相差一个苯环，使得ODBP-G的亲水性更强。与以DPA为供体的研究相比，甲氧基DPA与吡啶的结合可以显著猝灭探针的荧光。令人惊讶的是，尽管与水溶性的ODBP-G相比，OTBP-G相对疏水且不溶于水，但由于OTBP-G中高效电荷分离，系统间交叉（ISC）过程和TICT的协同效应使得OTBP-G仍能保持高背景比。经GGT水解后，两种探针可以产生分别称为OTBP和ODBP的NIR-II可激发的离子。

更重要的是，由于释放的荧光染料OTBP具有更强的AIE效应，OTBP-G表现出更好的开启性能，其聚集态发射比OTBP-G的背景信号亮1000倍。 因为大多数近红外发射探针在试管中的开启/关闭比小于200，故OTBP-G的开启/关闭效应非常高。OTBP-G实现了SBR>900的体外GGT活性的高灵敏度检测。在体内GGT成像中，作者使用1040nmfs激光在小鼠耳朵血管中实现了大于400的SBR。结果证明，1000倍的开/关比实现了生物环境中GGT检测“零”背景和高灵敏度。该研究利用OTBP-G在原位乳腺癌模型中进行体内肿瘤成像，并通过局部喷雾进行肿瘤转移的早期诊断，验证了OTBP-G良好的应用前景。

参考消息：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c03963

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