CAR-T细胞疗法是
一种革命性的癌症治疗方法，通过改造患者自身的T细胞，使其能够识别并攻击癌细胞。传统的CAR-T细胞通常只靶向一个抗原，如CD19或CD22，但这种方法可能导致肿瘤细胞通过丢失或下调抗原来逃避免疫攻击。
在接受CAR-T细胞治疗的患者中，约50%的患者在治疗后一年内复发，其中一部分是因为肿瘤细胞丢失了CAR-T细胞靶向的抗原。
研究者设计了一种trispecific新型
duoCAR-T的，它包含两个CAR开放阅读框，分别靶向CD19/CD20和CD22。这两个CAR通过P2A自切割肽连接，形成一个能够同时靶向三个抗原的CAR-T细胞。
测试了多种细胞内T细胞信号传导基序的组合，发现包含ICOS、
OX40
或CD27信号域的CAR结构比包含CD28或4-1BB的结构更有效。体外通过与表达CD19、CD20和CD22的肿瘤细胞共培养，评估三靶向CAR-T细胞的杀伤能力。在NSG小鼠模型中，评估三靶向CAR-T细胞对异种移植的白血病和淋巴瘤肿瘤的疗效。
主要结果
1、展示了四种duoCAR（D1、D2、D3和D4）的结构设计、表达和表征
T是Tandem双靶向CART，D1/2/3/4是不同结构的三靶向CART。每种duoCAR由两个CAR基因组成，通过P2A肽连接，形成一个双顺反子结构。
D1由靶向CD19和CD20的串联CAR（20-19 CAR）和靶向CD22的单CAR组成，包含ICOS共刺激域和CD3ζ激活域。
D2与D1类似，但将ICOS替换为OX40。
D3与D2类似，但CD22 CAR包含ICOS共刺激域。
D4由靶向CD20和CD19的串联CAR（包含CD27共刺激域）和靶向CD22的单CAR（包含ICOS共刺激域）组成。
2、DuoCARs D1, D2, D3, and D4在体外对肿瘤细胞的特异性毒性
UTD是未转导的空T细胞，M是mono单靶向CART，T是Tandem双靶向CART，D1/2/3/4是不同结构的三靶向CART
使用表达荧光素酶的Raji淋巴瘤细胞（CD19+CD20+CD22+）进行细胞毒性实验，结果显示所有duoCARs和对照CAR-T细胞在不同效应细胞与靶细胞（E:T）比例下均能剂量依赖性地杀伤靶细胞。duoCARs的杀伤能力比串联CAR T1更强。
3、CAR-T细胞对CD19+CD20+CD22+ Raji细胞的细胞因子释放
TA是Tumor alone，未经任何治疗组，UTD是未转导的空T细胞，M是mono单靶向CART，T是Tandem双靶向CART，D1/2/3/4是不同结构的三靶向CART
在NSG小鼠中建立Raji NHL异种移植模型，通过尾静脉注射Raji细胞和CAR-T细胞。结果显示，所有duoCAR-T细胞在高剂量（5×10⁶）和低剂量（2×10⁶）下均能显著抑制Raji肿瘤生长，而单靶向CAR-T细胞则不能。
在NALM-6 ALL模型中，duoCAR-T细胞也显示出显著的肿瘤抑制效果，与之前报道的CAR-T细胞疗效一致。
6、DuoCAR-T细胞在抗原异质性Raji肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性和持久性
在NSG小鼠中建立抗原异质性Raji肿瘤模型，将Raji19KO、Raji20KO、Raji22KO和Raji细胞按1:1:1:1比例混合后注射。结果显示，所有duoCAR-T细胞能够快速且完全地抵抗肿瘤，而单靶向CAR-T细胞则不能
7、DuoCAR D1、其组分T2和M22以及串联CAR T1激活的信号传导通路
在文章中，研究者们设计了四种三靶向duoCAR-T细胞（D1、D2、D3和D4），并对其进行了体外和体内实验，以评估它们的抗肿瘤效果。
NSG小鼠模型中，所有duoCAR-T细胞（D1、D2、D3和D4）均能显著抑制Raji NHL和NALM-6 ALL肿瘤的生长，而单靶向CAR-T细胞则不能。在抗原异质性Raji肿瘤模型中，D1、D2和D3 duoCAR-T细胞能够完全抵抗肿瘤，而D4的效果稍弱。D2和D3 duoCAR-T细胞在小鼠体内表现出较好的持久性，这可能与它们包含OX40共刺激域有关。
D2和D3结构在抗原异质性肿瘤模型中表现出色，能够完全清除肿瘤，并且在小鼠体内具有较好的持久性。这两种结构都包含OX40共刺激域，这可能有助于增强CAR-T细胞的持久性和抗肿瘤效果。
