武汉大学两位国家杰青联手，最新Nature Chemical Biology！

BioMed科技 · 公众号 · · 2025-01-18 19:29

正文

陈实（Chen Shi）入选美国微生物科学院院士，主持科技部重点专项、国家基金委杰出青年基金、重点国际合作项目、面上项目等。致力于微生物学、化学生物学、精准医学、基因组修饰与编辑、合成生物学与药物发现方面的研究。

王连荣 （Lianrong Wang），二级教授，博士生导师，国家杰青，国家优青，科技部重点专项首席科学家，中组部青年拔尖人才，教育部新世纪优秀人才，主要研究方向包括基因组表观遗传修饰与合成生物学以及表观遗传修饰的生物医学应用。

在原核生物中，DNA糖-磷酸骨架中的非桥接氧可被硫原子替代，形成磷硫酰化（PT）修饰，但其背后的机制一直是个谜。已知细菌为了抵御噬菌体的攻击，进化出了多种防御机制，其中Dnd和Ssp防御系统通过在DNA上进行PT修饰来区分自身DNA和外来DNA。Dnd系统在4-bp共识序列上催化双链DNA的PT修饰，而Ssp系统则在3-bp基序上诱导单链DNA的PT修饰。这些系统利用PT修饰作为标记，攻击不含PT的入侵DNA，但具体的硫原子整合机制尚不清楚。本研究旨在探索一种在极端嗜热菌中发现的新型DNA硫化系统TdpABC，该系统可能提供了不同于已知Dnd和Ssp系统的独特硫并入DNA骨架的策略。

武汉大学陈实 团队和 王连荣 团队，两个杰青团队联手通过计算预测模型，使用COG0175作为锚基因，在31,478个完整的细菌和古菌基因组中搜索新型DNA PT系统。他们发现了一个三基因簇，仅在嗜热细菌和超嗜热古菌中出现，这个基因簇被命名为tdpABC。通过质谱分析，研究者证实了JCM19900 DNA在酶促水解后产生了PT连接的d(GPSA)二核苷酸。相关内容以“A DNA phosphorothioation pathway via adenylated intermediate modulates Tdp machinery”发表于《 Nature Chemical Biology 》。

【主要内容】

图1 TdpABC赋予DNA PT修饰

图种展示了TdpABC基因簇在嗜热菌Thermus antranikianii JCM19900和古菌Sulfolobus islandicus HVE 10/4中的组织结构，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术检测了PT修饰的d(GPSA)二核苷酸。结果显示，TdpABC系统能够在5′-GATC-3′共识序列上进行PT修饰，且这种修饰在生理条件下主要以RP立体异构体形式存在。此外，通过将JCM19900的tdpABC基因簇导入不含有内源tdp基因的T. thermophilus HB8菌株中，成功实现了d(GPSA)修饰，进一步证实了TdpABC系统在DNA PT修饰中的作用。

图2 TdpC催化PT生物合成

实验结果显示，TdpC能够利用L-半胱氨酸、Na2S或Na2SO4作为硫源，在30-bp含有5′-GATC-3′序列的DNA底物上进行PT修饰。在标准条件下，TdpC在没有Mg ²⁺ 、Na ₂ S、ATP、L-半胱氨酸或IscS的情况下，以及在不同浓度的Na ₂ S或L-半胱氨酸存在下，对PT形成的影响进行了评估。动力学分析表明，TdpC对含有5′-GATC-3′序列的DNA底物的催化效率在使用L-半胱氨酸或硫化氢作为硫源时相似。此外，TdpC还能对半PT修饰的DNA底物进行进一步的PT修饰，表明TdpC可以识别并修饰已经部分修饰的DNA。这些结果共同证实了TdpC作为一个微型DNA PT修饰模块的功能，并揭示了其在PT形成中的独特硫并入途径。

图3 dpC催化DNA腺苷化

图中展示了TdpC的结构域组织，包括PP-loop和CXXC基序，这些结构域对于TdpC的功能至关重要。实验结果表明，TdpC具有ATP焦磷酸酶活性，能够水解ATP形成AMP和焦磷酸。通过单点突变K51和D52为丙氨酸，TdpC的ATP焦磷酸酶活性被消除，且这些突变体在体内和体外条件下均不能催化PT修饰，证实了PP-loop在DNA骨架硫化中的关键作用。此外，上图还展示了TdpC在体外对不同DNA底物的腺苷酸化活性，以及在添加游离硫化物或L-半胱氨酸和IscS脱硫酶后，腺苷酸化DNA中间体的减少和DNA PT修饰的增加，进一步阐明了TdpC在DNA PT修饰中的作用机制。

图4 TdpAB的抗病毒和生化活性

通过噬菌体斑点实验，展示了TdpABC及其衍生物在HB8细胞中对噬菌体TH115的抗性。TdpAB显示出DNA刺激的ATP酶活性，且这种活性在PT修饰的DNA存在下受到抑制，从而减少了TdpAB对自身DNA的核酸酶活性，避免了自身免疫。此外，TdpAB在体外对PT修饰的DNA显示出较低的核酸酶活性，而对未修饰的DNA则表现出较高的核酸酶活性。

图5 TdpAB-DNA的低温电镜结构

TdpAB复合体由TdpA六聚体和TdpB二聚体组成，形成一个通道，允许双链DNA通过。TdpA的P311、Q312和Y313残基与DNA的一条链形成螺旋楼梯状的氢键相互作用。AMPPNP的结合促进了TdpAB与DNA的结合，且PT修饰的DNA与TdpAB的结合亲和力更强，这可能是由于PT硫原子的疏水性和电静力特性增强了与TdpAB的相互作用。

图6 PT修饰可调节TdpAB-DNA相互作用

TdpAB对PT修饰的DNA比非PT DNA有更强的结合亲和力，但对RP或SP构型没有明显偏好。PT修饰通过影响TdpAB的DNA刺激ATP酶活性、ATP驱动的易位和转位偶联核酸酶活性来限制TdpAB复合体在自身DNA上的靶向搜索机制，从而防止自身免疫。同时，PT修饰的DNA对TdpAB核酸酶具有抗性，这为PT基TdpAB抗噬菌体防御提供了结构和功能基础。

武汉大学两位国家杰青联手，最新Nature Chemical Biology！

正文

请到「今天看啥」查看全文