线粒体DNA突变相关疾病的治疗是亟待突破的难题。鉴于传统药物治疗手段在疗效上的局限性，科研人员正积极探索更高效、精准的治疗策略。基因编辑技术凭借其能够直接修正线粒体DNA突变的独特优势，正逐步成为治疗线粒体疾病领域最具前景的方法之一。2020年，David R. Liu团队将DddAtoxin与TALE技术融合，研发出一种新型的双链DNA单碱基编辑工具——DdCBE，能够有效编辑线粒体DNA，标志着基因编辑技术在治疗线粒体疾病的征途上迈出了重要一步。然而，随着研究的深入，科研人员发现野生型DdCBE会引发严重的线粒体及细胞核基因组脱靶效应。这一发现对其在临床实践中的安全性构成了严峻考验，并立即引起学术界与工业界的广泛关注与深入讨论。基因编辑技术在医学与农业育种两大前沿领域均凸显出非凡的应用潜力。然而，技术伴随的脱靶效应已成为不容忽视的挑战。在医学界，多个监管机构已明确指出，基因编辑技术应用于医疗实践前，需要进行严格的安全性评估，特别是对脱靶效应的全方位考量，视为不可或缺的环节。在动物育种领域，脱靶效应同样是培育新品种的重要考虑因素。因此，降低DdCBE脱靶效应，是关键步骤，在一定程度上决定其是否能进一步应用。近日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究团队于Cell Research期刊上在线发表题为Reducing off-target effects of DdCBEs by reversing amino acid charge near DNA interaction sites的研究文章。该研究利用DddAtoxin晶体结构数据以及Alphafold2蛋白质三维结构预测技术，预测了脱靶效应产生相关的重要氨基酸位点，利用蛋白工程策略，突变相应氨基酸，并通过活性测试和GOTI(Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection) 脱靶效应评估，发现，DdCBEK1402D/E突变体脱靶效应相较于野生型DdCBE降低了惊人的400至1000倍，几乎达到了对照组的本底噪声水平。这一研究成果为线粒体胞嘧啶碱基编辑器的安全性改善作出了重要贡献，在线粒体水平、基因组水平显示极低脱靶效应的DdCBEK1402D/E编辑器也展现了巨大的临床应用潜力。值得一提的是，该研究中所使用的GOTI基因编辑脱靶效应评价方案是目前针对DdCBE基因组脱靶效应评价的重要方法之一。基因组的杂合性是脱靶效应评价面临的瓶颈。即细胞在有丝分裂过程中基因组复制的微小错误不断累积，导致不同细胞间存在显著差异，形成了庞大的背景信号。这些背景信号会掩盖基因编辑造成的脱靶效应，增加了检测的难度。小鼠胚胎从1细胞阶段的受精卵发育到2细胞阶段，仅发生一次有丝分裂，细胞间基因组差异极小，基因编辑一个细胞，另一个细胞作为对照，创新构建了GOTI脱靶效应评价技术，目前已经成功用于多种基因编辑工具脱靶效应评价。图1.高精度线粒体单碱基编辑工具的研发；a-b. 预测DddAtoxin元件可能引起脱靶效应的氨基酸位点；c-e. DdCBEK1402D/E 在线粒体进行不同位点（c: mND5-site2, d: mND2-site2）进行基因编辑时都显著降低了脱靶效应，且在多种变体中表现出最小的编辑窗口，并保持与野生型DdCBE一致的基因编辑效率；f-g. 利用GOTI技术进行脱靶效应评估（f）发现DdCBEK1402D/E 对比于野生型的DdCBE，其脱靶效应降低了400-1000倍 (g)；h-i. 在野生型的DdCBE中，发生的大量脱靶位点与多种预测工具几乎没有重合(h)，具有随机性，并具有明显的C/G>T/A的特征（i）, 而DdCBEK1402D/E 没有明显的C/G>T/A脱靶特征。
中国农业科学院深圳农业基因组研究所的左二伟研究员是论文的通讯作者，博士后谢龙、博士生曹雅琪和李迪，硕士生马梦雪和焦丹荣是论文的共同第一作者。近年来，左二伟课题组聚焦于基因编辑技术的精度与效率问题，利用分子生物学，生物信息学理论和技术，研发多种高精度基因编辑技术。课题组诚聘具有结构生物学、计算生物学、分子生物学以及细胞生物学等学科背景，近期毕业的博士从事基因编辑技术研发与应用研究。https://www.nature.com/articles/s41422-024-01028-w制版人：十一
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