大家好！今天来了解一篇细胞对细胞外基质粘性能量耗散的反应的研究——《Cell response to extracellular matrix viscous energy dissipation outweighs high-rigidity sensing》发表于《SCIENCE ADVANCES》。我们都知道，细胞生存的环境中，细胞外基质就像一个大舞台，影响着细胞的一举一动。而其中，基质的粘性能量耗散在细胞的行为调控中扮演着重要角色。以往研究对其在高刚性传感方面的情况还不明晰，要深入探究
细胞对细胞外基质粘性能量耗散的反应
，让我们一起看看细胞在这个过程中到底经历了什么奇妙变化吧！
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本文只做阅读笔记分享
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一、研究背景
细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用在生物学中极为重要，许多疾病都与细胞-ECM相互作用的紊乱有关。ECM的力学性质，如刚度和粘弹性，对细胞行为和命运有着关键影响。刚度的失调与多种疾病相关，例如在病理衰老、纤维化和癌症中都涉及到刚度的异常变化。近年来，人们发现ECM的能量耗散特性也会影响细胞行为，但相关机制尚不清楚。分子离合器模型对细胞在ECM上的机械传感机制有一定解释，但在高刚度基质中粘性能量耗散对细胞机械传感的影响方面，理论与实验数据存在矛盾，这为本研究提供了切入点。
二、实验材料与方法
（一）蛋白水凝胶制备
1、构建块设计与合成
本研究以titin的I91结构域为基础设计聚蛋白构建块。通过聚合酶链反应（PCR）添加连接氨基酸和用于交联的酪氨酸，构建了三种不同的构建块：H10、H25和H25′。H10是参考构建块，H25通过缩短免疫球蛋白（Ig）结构域之间的连接子长度（仅为2个氨基酸）来改变其粘弹性，H25′则是将酪氨酸从Ig结构域突变并置于随机卷曲连接子中，从而改变纳米级拉伸几何形状。
这些构建块的cDNA通过特定的克隆策略插入表达质粒，并在大肠杆菌中表达和纯化。蛋白质的纯度通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评估，浓度通过测量A280并结合理论消光系数估算。
2、水凝胶形成与交联
利用介导的光化学交联策略，以酪氨酸残基为靶点，将纯化后的蛋白交联成水凝胶。在制备用于单轴拉伸测试的圆柱形水凝胶时，将蛋白与交联剂混合后注入聚四氟乙烯管中，在特定光照条件下交联，然后取出并储存于缓冲液中。对于圆盘形水凝胶，将蛋白交联在经过等离子体激活的圆形玻璃盖玻片上，交联后进行洗涤、涂层（如纤连蛋白或RGD肽）等处理。
（二）细胞培养与处理
1、细胞培养条件
RPE-1细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco’s改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）中培养，间充质干细胞则在含有相同添加剂的DMEM中培养。细胞维持在亚汇合状态，定期更换培养基。
2、细胞接种与处理
进行细胞机械生物学实验时，将RPE-1细胞和间充质干细胞以50%的汇合度接种在水凝胶表面，在相应培养基中附着约12小时后进行后续处理。细胞可用于RNA分离（保存于RNAlater中）或免疫染色（固定于4%多聚甲醛中）。在代谢活性测定实验中，细胞以80%的汇合度接种并过夜培养。
（三）检测方法
1、细胞代谢活性检测
采用MTT法，将细胞培养基替换为含2%胎牛血清的Hanks’平衡盐溶液，加入MTT溶液，细胞内的线粒体脱氢酶可代谢MTT，产生紫色的MTT甲臜晶体。之后用HCl-异丙醇溶解晶体，测量570nm处的吸光度，减去690nm处的背景吸光度，吸光度信号与代谢活跃细胞的数量成正比。
2、免疫细胞化学检测
细胞经过洗涤、固定、通透处理后，用特异性抗体进行免疫染色。例如，用抗YAP抗体检测YAP的定位，用鬼笔环肽染色肌动蛋白，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核。通过激光扫描共聚焦显微镜采集图像，使用ImageJ软件分析YAP核定位比率（YAP信号在细胞核内特定区域强度总和与在细胞质内相同区域强度总和的比值）、细胞铺展面积（手动分割细胞外膜后用ImageJ计算）和焦点粘附长度（在ImageJ上手动量化）。
3、实时定量PCR检测
利用TRIzol和RNAeasymicro试剂盒提取细胞总RNA，取150ngRNA进行反转录，然后用SYBRGreen进行qPCR，并设置非模板对照。结果以内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶和β-肌动蛋白为参照进行归一化，引物序列可在表S1中找到。
4、细胞骨架抑制实验
在细胞接种12小时后，分别加入细胞松弛素D、blebbistatin或Y-27632等抑制剂，孵育1小时。然后洗涤细胞，进行免疫染色，观察抑制剂对细胞骨架相关指标（如YAP核定位、细胞铺展等）的影响。
（四）力学性能测试
1、拉伸测试
使用自制的拉伸测试仪对圆柱形水凝胶进行测试。在50mM磷酸钠（pH7.5）和150mMNaCl缓冲液中，以5mm/s的速率施加和移除应变进行应力-应变测试，计算表观弹性模量（E）；在应力松弛测量中，保持应变恒定，记录负载随时间的变化，评估能量耗散（通过加载和卸载应力-应变曲线之间的滞后面积与加载应力-应变曲线下面积的比值计算）。
2、纳米力学光谱测试（AFM）
利用JPKNanoWizard3原子力显微镜对水凝胶样品进行测量。使用BL-AC40TS悬臂梁，校准力常数后，在五个不同位置进行力-距离曲线（FDCs）测量，每个位置采集10条FDCs。通过将FDCs的接近部分拟合到抛物线尖端的Sneddon模型来获得杨氏模量，从150nm压痕处FDCs的接近和回缩部分之间的封闭区域获得粘弹性变形过程中的能量耗散，分析时不考虑粘附事件。
三、实验结果与分析
（一）蛋白水凝胶的力学性能
1、应力-应变曲线与弹性模量
三种蛋白水凝胶（H10、H25、H25′）的应力-应变曲线显示出典型的粘弹性材料特征，即加载和卸载曲线之间存在滞后现象，且有明显的应变硬化。
H10和H25水凝胶的零应变表观弹性模量约为20kPa，H25′约为30kPa。H25水凝胶由于连接子较短，比H10和H25′经历更明显的应变硬化。
2、能量耗散特性
在应力-应变循环中，H25水凝胶在中等和大应变下比H10更具能量耗散性，H25′也比H10耗散更多能量。
从AFM压痕实验得到了相似结论，且后续加载应力-应变曲线在很大程度上重叠，表明三种材料的塑性变形可忽略不计。
（二）细胞在不同基质上的机械传感
1、YAP核定位与细胞铺展
在弹性PAAm水凝胶上，RPE-1细胞在硬基质（约20kPa）上呈现YAP核定位，而在软基质（约2.8kPa）上则无，且YAP核定位与细胞铺展增加和YAP靶基因表达相关。然而，在三种蛋白水凝胶中，最强烈的YAP核染色出现在最软且能量耗散最少的H10上，同时伴随着更多的细胞铺展和更高的YAP靶基因表达（特别是与H25基质相比），以及更大的周边焦点粘附形成。在人间充质干细胞中也得到了类似的YAP激活和细胞铺展模式，在RGD肽涂层或含RGD序列的蛋白水凝胶上培养的RPE-1细胞中也观察到了相同趋势。
2、基质刚度与能量耗散的影响
通过拉伸H10和H25水凝胶并监测应力松弛，发现尽管H25更具能量耗散性，但在所有应变和时间下，H25水凝胶产生的应力均高于H10，且预测H25在应变24小时后仍更硬。
这表明在高基质刚性背景下，RPE-1细胞在H25和H25′基质上机械传感降低并非因基质实际应力不足，因为在非常硬的非耗散性玻璃上，细胞机械传感仍然很高，且未发现细胞骨架软化的证据，从而有力地支持了粘性能量耗散减弱了细胞对硬基质的机械传感反应这一结论。
（三）分子离合器在细胞响应中的作用
1、抑制剂对细胞机械传感的影响
用1μM细胞松弛素D（抑制肌动蛋白聚合）处理细胞后，无论使用何种底物，核YAP水平均降低，且细胞和细胞核面积基本不变，但YAP定位似乎仍遵循底物刚度。用10μMblebbistatin（降低肌球蛋白牵拉速率）处理后，H25和H25′基质上的YAP核定位增加，而H10上降低，此时YAP活性明显遵循底物刚度，且与细胞和细胞核面积相关。
25μMRho-激酶（Rock）抑制剂Y-27632实验也显示三种基质中的细胞机械传感减弱，这与Rock促进肌动蛋白聚合和肌球蛋白活性的作用一致。这些结果表明分子离合器参与了细胞对粘性能量耗散底物刚性的钝化响应，且blebbistatin的结果表明肌球蛋白牵拉速率影响粘弹性底物驱动的机械传感。
