在浏览 PubMed 时，夏老师留意到一篇颇为有趣的文章。该文章由复旦大学发表于影响因子 11.7 分的 Science 子刊 Sci Adv上，做的是巨噬细胞的代谢重编程对肝细胞脂肪生成的影响，进而探究其在预防 MASH（脂肪性肝炎）发展方面的作用 （
这样的文章有趣的关键，就是文章本身都是通过假设迭代，一步步验证出来的，而不是那些所谓的科研套路，在验证之前就已经预设了一个结论，不清楚科研推理或者假设，以及所谓科研套路的话，科研去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）：
研究人员运用 WD（西方饮食）构建了 NASH（非酒精性脂肪肝炎）模型，也可称之为 MASH（代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎）模型。他们发现，在小鼠接受 WD 饮食后，巨噬细胞中的 FAO（脂肪酸氧化）显著下降，同时葡萄糖含量大幅增多，这表明巨噬细胞的代谢发生了改变。在此过程中，巨噬细胞中 ATF3 的表达也明显降低。鉴于此前他们主要研究巨噬细胞 ATF3 表达与 MASH 指数的关联，于是对 ATF3 进行了基因操作，包括过表达和敲减（
这实际上是对柯霍氏法则的验证，通过移除潜在的关键银子ATF3，来查看对于下游的MASH表型会产生什么样的影响，若不了解柯霍氏法则，可以看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》
）。结果显示，肝脏巨噬细胞中 ATF3 与 MASH 评分呈负相关，且 ATF3 的表达会影响巨噬细胞中葡萄糖的累积以及 FAO，这意味着 ATF3 或许是肝巨噬细胞中促使葡萄糖减少、提升 FAO 的关键因子 ：
紧接着，研究团队对过表达或敲减巨噬细胞 ATF3 的效果展开进一步验证。（
这一部分验证其实就是展开原有的体外验证结果，将原有的假设进行迭代的过程，由于原有的假设仅针对体外细胞验证，迭代了假设后，提出了ATF3对于体内环境的巨噬细胞可能也有类似的影响，假设迭代也就是推进课题进展的关键，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）他们将过表达或敲减 ATF3 的巨噬细胞注射到小鼠体内，随后观察 WD 喂食小鼠肝脏细胞的 MASH 进展情况，涵盖脂肪累积和炎症状态。结果表明，ATF3 能够预防 WD 饮食引发的肝脏炎症 ：
那么，ATF3 具体通过哪些基因发挥这种代谢重编程功能呢？为此，研究人员开展了二代测序（
下方的火山图大家应该能够理解，其展示的是 ATF3 表达对于所对应的转录组基因表达的影响，通过散点图将表达差异以及表达的p值都展示在这一张图上，若对火山图不熟悉，可参考《夏老师带你读文献》
）。结果显示，ATF3 缺失后，糖异生相关的基因活性增强，同时脂肪酸摄取或 FAO 相关基因的表达减弱 ：
不过，通过 CUT&Tag 染色质分析检测发现，这些过程并非 ATF3 直接调控的下游作用，而是间接影响。ATF3 的缺失降低了 AMPKα 的磷酸化水平（
若熟悉 AMPK 信号通路便会知晓，该通路实则也是受能量代谢响应的信号通路，通过ATP/ADP的浓度差异，会激活AMPK的磷酸化，导致下游AMPK信号通路的激活，而AMPK信号通路下游基因也有很多与能量代谢有关，若不熟悉AMPK信号通路，可查看《信号通路是什么鬼？》系列里的相关章节
）。通过使用 AMPK 的抑制剂，研究人员发现糖酵解位于 ATF3 与 AMPK 的上游，而 AMPK 可能处于 FAO 的上游，即 ATF3 可能通过抑制糖异生来调节 FAO。
既然 ATF3 无法直接结合糖异生相关基因染色质，那么它究竟是如何调控的呢？研究人员发现 ATF3 能与 FOXO1 产生关联（
提到 FOXO，想必大家并不陌生，它是 FOXO 信号通路中关键的转录因子，需通过乙酰化和去乙酰化进行调控，入核激活FOXO信号通路，如果不记得FOXO信号通路，可以去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列里相关章节复习下
）。他们发现，在 WD 喂养的小鼠肝巨噬细胞中，FOXO1 的乙酰化水平降低，而 ATF3 能够促进 FOXO1 的乙酰化。通过对 FOXO3 的乙酰化位点进行突变，研究人员证实 ATF3 通过阻断 HDAC1 介导的 FOXO1 去乙酰化过程，进而增强 FOXO1 的乙酰化 ：
另一方面，ATF3 能够促进 CD36 的表达，增加肝巨噬细胞中脂肪酸的摄取。这背后的机制又是怎样的呢？由于在转录水平上 ATF3 并未对 CD36 产生影响，于是研究人员着眼于 CD36 的蛋白修饰。结果发现，ATF3 通过直接上调棕榈酰化相关酶，提高了 CD36 的棕榈酰化水平。对 CD36 的棕榈酰化位点进行突变，可部分抑制巨噬细胞脂肪酸的摄取（
这同样是对柯霍氏法则的验证，只不过通过突变验证，通过缩小了命题中概念的外延，能更有效地规避肯定后件带来的逻辑谬误，如果不清楚概念的外延和内涵以及肯定后件逻辑谬误，可查看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。
注射过表达 ATF3 的巨噬细胞后，能够有效抑制肝细胞的脂肪生成，巨噬细胞中 ATF3 增强的 FAO 可减轻肝脂肪变性和纤维化。这表明，其间或许存在细胞间的相互作用 ：
通过测序结果，研究人员发现 RBP4 或 FGF21 可能参与巨噬细胞 ATF3 对肝细胞的功能调节，且 ATF3 缺失会致使 RBP4 表达显著增加。于是，他们对 RBP4 进行敲除，并开展了 FGF21 的阻断实验。结果显示，ATF3 通过抑制 RBP4，从而抑制肝细胞脂肪生成以及肝星状细胞活化引发的肝纤维化。而 FGF21 的阻断实验并未呈现出明显效果 ：
最后，研究人员分析了 RBP4 敲除或使用抗 RBP4 抗体对 WD 饮食小鼠产生的影响。结果发现，抑制 RBP4 后，WD 饮食小鼠的 MASH 指数以及纤维化状况得到显著改善。这意味着靶向抑制 RBP4，能够预防巨噬细胞 ATF3 失活以及 WD 诱导的 MASH 进展 ：
最终，研究人员构建了如下示意图：巨噬细胞中的 ATF3 能够通过间接作用，即对 CD36 的棕榈酰化以及 FOXO1 的乙酰化，促进 FAO 并激活糖异生，影响 AMPK 信号通路，实现对巨噬细胞的代谢重编程。与此同时，ATF3 会抑制 RBP4 的表达，进而阻止肝脏细胞的脂肪生成以及纤维化 ：
总体而言，这篇文章的研究工作完成得相当出色。尤其是在分析 ATF3 对 FOXO1 乙酰化以及 CD36 棕榈酰化的间接作用方面，所提出的假设颇为大胆，且均得到了相应实验结果的支撑。此外，文章还深入剖析了 ATF3 对下游 RBP4 的影响，进而阐释了巨噬细胞对肝细胞脂肪生成和纤维化的作用机制，并通过 RBP4 的阻断实验加以验证。当然，这篇文章也存在些许不足。从上述示意图中便能看出，ATF3 的活动未能完全建立起巨噬细胞代谢重编程与 RBP4 之间的紧密联系，这或许将成为该实验室后续研究的方向。尽管如此，这篇文章的整体研究仍具有较高价值。好了，今天的分享就到此为止，感兴趣的话可以查阅原文，希望大家都能从中有所收获。
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