为了确定ELS如何影响PFC的功能，本项研究采用了早期母系分离应激范式（early maternal separation stress paradigm）。其做法是在幼崽出生后的第8天(P8)，让其经历一次24小时的母亲-幼崽分离，从而破坏了幼鼠早期的社交联系。
有文献报道，应激可以诱导成年小鼠PFC中的树突棘缺失，因此，作者研究了ELS是否在母系分离后不久即可导致PFC中第2/3层锥体神经元兴奋性突触的结构改变。另外，ELS幼鼠背侧PFC中第2/3层锥体神经元上的树突棘密度显著增加，但不影响树突棘的大小和形态。
为了评估树突棘密度的改变是否反映了功能的改变，研究人员对P9-P10 ELS和对照幼鼠进行全细胞膜片钳实验。与结构变化一致，ELS暴露显著增加了微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)的频率，但幅值没有改变，而ELS的微小抑制性突触后电流(mIPSC)频率和幅值均未发生改变。
这些结果表明，ELS选择性地增加了PFC第2/3层锥体神经元的兴奋性突触密度，且这一过程发生在出生后的早期发育中，提示ELS暴露后前额叶突触兴奋抑制比增加。
单次ELS暴露增加了突触的兴奋抑制比
因为ELS诱导的突触变化在PFC中很明显，因此作者想知道PFC投射至VTA的DA神经元是否以及如何受到ELS的影响。因此，作者在P1小鼠的背侧PFC脑区注射了逆向标记的微球，特异性标记由PFC投射向VTA的神经元，进而通过膜片钳记录观察到ELS小鼠DA神经元表现出超兴奋性，但静息膜电位和尖峰阈值不受影响。
然而，作者发现PFC投射到VTA的神经元表现出阳离子通道介导的电流(Ih)上调，这是VTA神经元的兴奋性驱动力。这些发现表明，ELS使得中额叶VTA中DA神经元的兴奋性Ih电流增强，从而导致了这些细胞超兴奋性。
ELS小鼠中额叶VTA 的DA神经元表现出固有兴奋性增加
目前，单次暴露的早期生活应激是否会长期影响PFC的突触变化和PFC投射的DA神经调节回路的活动，依然尚不清楚。结果发现，在P8的单次ELS会导致PFC 2/3层锥体神经元兴奋性突触密度的长期增加，而不是抑制性突触密度的长期增加，以及在P17-P21时通过双光子检测到，VTA中DA神经元内在兴奋性的持续增加。
此外，还观察到中额叶DA神经元的过度兴奋是由Ih电流增强引起的，而静息膜电位和峰值阈值电位没有变化。这些结果表明，急性ELS导致了VTA中DA神经元兴奋性的长期增强，潜在地增加了PFC中多巴胺的释放，并在PFC观察到兴奋性突触的显著增加。
ELS诱导的PFC兴奋性突触密度增强和PFC投射到VTA的 DA神经元的活性增加是持续性的
作者推测，PFC中的DA信号可能与ELS诱导的突触改变有关。为了检验这一假说，作者在P1幼崽局部注射神经毒素6-羟多巴胺（6-OHDA）来消除PFC中的DA能神经元。
研究发现，向小鼠PFC注射6-OHDA后树突棘密度明显下降，且mEPSC频率的显著降低。然而，在注射6-OHDA的ELS小鼠中没有观察到脊椎密度或mEPSC频率的进一步增强。这说明内源性DA对出生后早期PFC的发育至关重要。
因此，作者进一步研究了不同的DA受体信号如何选择性地促进了ELS诱导的PFC突触的异常发育。在ELS期间，作者将D1受体拮抗剂或D2受体拮抗剂直接微注射到PFC中，并在P9 P10时测量了药物注射ELS小鼠的mEPSCs。
其中，对D2受体的阻断完全消除了ELS介导的mEPSC频率的增强，而不影响mEPSC的幅值。综上说明，通过增强中额叶DA神经元的活性，上调DA D2受体信号，促进了ELS后PFC中2/3层锥体神经元兴奋性突触的增加。
