纯安利，生信基础也很重要

常有小伙伴在后台给小编留言，作为生信人的忠实粉丝，他常常自诩为是一个合格的生信人，生信文章看了好几篇了，R语言代码也敲了好几行了，生信人词汇例如“转录组”，“差异基因”等也能脱口而出，就是少了一篇属于自己的生信Article，每当要实战的时候，不是思路卡壳就是运用不熟，问题出在哪里呢？

知之为知之，不知为不知，实战时候的生疏源自于咱们对知识的一知半解，举个例子，你真的掌握生信基本功转录组了吗？小编今天和大家温习一下转录组知识点，敲黑板划重点啦，速速记笔记！

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一、什么是转录组学？

转录组学是研究生物体内所有转录 RNA（mRNA、非编码RNA 包括siRNA、miRNA、lincRNA 等）的总体表达及其调控的学科。它通过高通量测序技术，全面地分析和识别细胞或组织中的转录本，并通过生物信息学方法对其进行定量和功能分析，以揭示基因的表达调控网络和相关生物学功能。转录组学的发展为我们深入了解基因表达调控、细胞信号传导及疾病发生机制提供了重要的工具和途径。

图1. 分子生物学基本原则——中心法则（图片来源维基百科）

二、转录组学的分类

根据研究内容的不同，转录组学可以分为几种主要类别：

功能转录组学 （ Functional Transcriptomics）：这一类转录组学主要关注基因的功能，包括了解特定基因的表达如何影响生物体的生理过程和代谢途径。研究者可能会关注特定生物过程或细胞功能，并通过分析转录组数据来揭示相关基因的表达模式及其在这些功能中的作用。

疾病转录组学 （ Disease Transcriptomics）：这一领域致力于理解基因表达与疾病之间的关系。研究者可能会比较健康组织与患有特定疾病的组织之间的转录组差异，以发现潜在的疾病标志物、病因和治疗靶点。

药物转录组学 （ Pharmacological Transcriptomics）：这一领域探讨药物对基因表达的影响，以及基因表达变化如何影响药物的疗效和副作用。药物转录组学可以帮助优化药物治疗方案，实现个体化医疗。

环境转录组学 （ Environmental Transcriptomics）：这一领域研究环境因素对基因表达的影响。研究者可能会调查环境因子（如毒素、营养物质、温度等）如何改变生物体的基因表达模式，以及这些变化对生物体适应能力和生态系统功能的影响。

发育转录组学 （ Developmental Transcriptomics）：这一领域关注生物体在发育过程中基因表达的动态变化。研究者可能会研究不同发育阶段或组织类型的基因表达模式，以揭示发育过程中基因调控网络的变化和调节机制。

图2.以疾病转录组学为例，单细胞RNA测序、单核RNA测序和空间转录组学研究揭示了人类神经系统疾病中细胞和分子的异质性（图片来源：DOI: 10.1038/s41582-023-00809-y）

三、转录组学分析流程

转录组学的分析流程通常包括以下几个主要步骤：

1.实验设计和样本准备：

· 确定研究目的和假设。

· 设计实验方案，包括样本的选择、处理和实验分组。

· 收集和准备RNA样本，确保样本的质量和纯度。

2.RNA提取和准备：

· 提取RNA样本，通常使用RNA提取试剂盒或其他RNA提取方法。

· 检测RNA的质量和纯度，如使用琼脂糖凝胶电泳或分光光度法。

· 根据实验设计和目的，选择合适的RNA样本准备方法，如rRNA去除、转录、建库等。

3.测序：

· 进行RNA测序，根据实验需求选择合适的测序技术，如RNA-seq、单细胞RNA-seq等。

· 使用高通量测序平台进行测序，如Illumina HiSeq、NovaSeq等。

· 确保测序数据的质量和可靠性，包括测序深度、覆盖度等指标。

4.数据预处理：

· 对原始测序数据进行质量控制和过滤，包括去除低质量序列、接头序列和PCR重复序列等。

· 进行序列比对，将测序 reads 映射到参考基因组或转录组上。

· 对于单细胞RNA-seq数据，通常需要进行细胞质量控制和聚类分析。

5.基因表达分析：

· 根据测序数据进行基因表达定量分析，包括差异表达基因分析、聚类分析、功能富集分析等。

· 通过统计学方法和生物信息学工具识别差异表达基因，并对其功能进行注释和解释。

6.生物学解释和结果验证：

· 解释差异表达基因的生物学意义，探索其在生物学过程中的功能和调控网络。

· 进行实验验证，如定量PCR、免疫印迹、功能实验等，以验证差异表达基因的功能和作用机制。

7.数据可视化和报告：

· 使用数据可视化工具将分析结果可视化，如热图、散点图、通路图等。

· 撰写实验报告或论文，总结研究结果、讨论发现、提出结论，并撰写材料和方法部分。

图3. 以空间转录组学为例的转录组分析流程（图片来源：DOI: 10.1038/s41586-021-03634-9）

四、转录组学相关测序详解

转录组学相关的测序技术主要用于分析细胞或组织中的所有基因的转录活动。下面详细介绍几种常见的转录组学测序技术：

1.芯片测序技术（microarray sequencing）

· 原理： 基因芯片是一种固相支持的平台，上面固定了成千上万个已知的基因序列探针。RNA样本经过反转录和标记后与芯片上的探针杂交，通过检测标记的强度来确定每个基因的表达水平。

· 应用： 基因表达分析、基因调控网络分析、生物标记物筛选

· 常见平台： 常见的芯片测序技术平台包括Affymetrix GeneChip、Agilent SurePrint、Agilent SurePrint等。

· 优缺点： 高通量、高灵敏度、成本相对较低、数据分析相对简单。但受限于芯片设计，只能检测已知的基因，不适用于发现新基因或未知转录本；动态范围较窄，难以检测低表达水平的基因。

2.RNA测序（RNA-Seq）：

· 原理： RNA测序是最常用的转录组学测序技术之一。它通过将RNA样本转录成cDNA，然后利用高通量测序技术对cDNA进行测序，以获得RNA的序列信息。

· 应用： RNA测序可用于检测基因的表达水平、发现新的转录本、揭示剪接变异、鉴定转录起始位点和终止位点等。

· 常见平台： 常见的RNA测序平台包括Illumina HiSeq、NovaSeq等。

· 优缺点： 高分辨率、高灵敏度、宽动态范围、适用于各种样本类型，但需要较高的成本和较长的分析时间。

3.单细胞RNA测序（Single-cell RNA-Seq）：

· 原理： 单细胞RNA测序是针对单个细胞的RNA进行测序的技术，可以揭示不同细胞类型之间的异质性和功能差异。

· 应用： 单细胞RNA测序可用于研究细胞类型的分化、细胞群体的功能异质性、细胞在疾病发展过程中的变化等。

· 常见平台： 常见的单细胞RNA测序平台包括10x Genomics、Drop-seq等。

· 优缺点： 揭示单个细胞的表达谱，能够发现罕见细胞类型。技术复杂、数据处理困难、成本较高。

4.空间转录组测序（Spatial Transcriptomics）：

· 原理： 空间转录组测序是一种用于探究组织或细胞内基因表达空间分布的技术，可以在组织切片上保留空间信息的同时进行RNA测序。

· 应用 ： 空间转录组测序可用于研究组织结构和基因表达模式之间的空间关系，揭示基因在组织中的定位和相互作用。

· 常见平台 ： 常见的空间转录组测序平台包括10x Genomics Visium、NanoString GeoMx DSP等。

· 优缺点： 提供基因表达的空间信息，揭示基因在组织中的定位和相互作用。技术复杂、数据处理相对困难，成本较高。

5.长读长测序（Long-read Sequencing）：

· 原理： 长读测序技术能够产生比传统测序技术更长的DNA或RNA序列，从而更好地解析转录本的结构和多样性。