撰文｜风I型糖尿病是自身免疫系统攻击胰岛β细胞引起胰岛素分泌功能进行性损害而导致的糖代谢紊乱。因此，寻找胰岛抗原特异性CD4+T/CD8+T细胞是厘清I型糖尿病免疫机制的关键。既往研究发现，胰岛素B链9-23来源肽段（InsB9-23）（详见BioArt报道：Nat Immuno | 胰岛MHC-II肽组揭示自身免疫肽的主要特征）和胰岛素杂交肽（hybrid-insulin peptide，HIP），包括胰岛素C链与嗜铬素A形成的杂交肽（InsC-ChgA）【1】和胰岛素C链与胰岛淀粉样多肽形成的杂交肽（InsC-IAPP）【2】，作为免疫原刺激抗原特异性CD4+T细胞免疫应答参与I型糖尿病。然而，有意思的是，虽然InsB9-23的16位酪氨酸替换为丙氨酸或者ChgA敲除抵抗糖尿病发展，但IAPP缺陷并不能阻碍糖尿病，表明胰岛素相关抗原在糖尿病免疫致病机制中的作用并非等价。InsC-ChgA是自发糖尿病NOD小鼠自身反应性CD4+T细胞的重要靶抗原。首先，相比于InsB 和InsC-IAPP ，InsC-ChgA特异性CD4+T细胞在胰岛内浸润数量多且在胰腺引流淋巴结内活化【3】；其次，InsC-ChgA特异性CD4+T细胞高表达IFNγ而Treg比例降低，表明效应表型【3】；最后，BDC-2.5 TCR转基因小鼠CD4+T细胞过继迅速诱导糖尿病【4】。尽管如此，InsC-ChgA特异性CD4+T细胞如何遭遇抗原并产生免疫应答仍不清楚。近日，美国明尼苏达大学免疫学中心Brian T. Fife研究团队在Immunity杂志在线发表题为CD4+ T cells reactive to a hybrid peptide from insulin-chromogranin A adopt a distinct effector fate and are pathogenic in autoimmune diabetes的研究文章。该研究揭示胰岛抗原特异性T细胞的致病性差异，并指出InsC-ChgA T细胞倾向Th1分化进而诱导自身免疫性糖尿病的发生，为理解I型糖尿病的免疫机制以及治疗I型糖尿病提供新的思路。
团队首先将多克隆InsC-ChgA、InsC-IAPP、InsB和鸡卵溶菌酶 (hen egg lysozyme，HEL10-18)-特异性对照CD4+T细胞经体外扩增纯化后过继入NOD-Rag1-/-小鼠监测糖尿病发生率，结果发现在第35天所有接受InsC-ChgA特异性T细胞的小鼠均发病，而接受InsC-IAPP的仅有33%发病，接受InsB和HEL10-18的小鼠均未发病。有意思的是，当InsB特异性T细胞与IGRP-特异性NY8.3 T细胞共同过继时，小鼠迅速发病，提示其CD8+T细胞依赖的致病作用，而InsC-ChgA特异性细胞可以直接诱导疾病。总之，这些数据表明HIP-反应CD4+T细胞比InsB反应T细胞具有更强的致病潜能。随后，作者在NOD小鼠的2、3、4、5和10周同时监测胰腺引流淋巴结（pLN）和次级淋巴器官（SLO）的InsC-ChgA、InsC-IAPP和InsB特异性CD4+T细胞的表型。结果发现在pLN和SLO，InsC-ChgA和InsB特异性CD4+T细胞的比例均显著高于InsC-IAPP CD4+T细胞。然而，仅在第二周，就有80%和60%的InsC-ChgA特异性CD4+T细胞在pLN和SLO处于CD44+活化状态。相反，大部分InsC-IAPP和InsB特异性CD4+T细胞则处于初始状态。是否抗原提呈的差异导致活化的不同？作者将CTV标记的InsC-ChgA特异性BDC-2.5 CD4+T细胞和InsB-特异性 8F10 CD4+T细胞过继入1天、5天、1周和3周NODWT小鼠，监测腹股沟淋巴结（iLN）和pLN内的增殖情况。结果发现第一天和第五天T细胞增殖较少，然而在第1周，过继30-50%的T细胞在pLN出现明显增殖，且在两种CD4+T细胞之间没有差异。同时，体内内源性增殖实验（BrdU+FTY720）同样证实第二周pLN中InsC-ChgA和InsB抗原特异性T细胞增殖能力相同，表明抗原提呈可能并不是T细胞活化不同的原因。考虑到cDC1在抗原交叉提呈中的作用【5】，作者猜测cDC1对于pLN中T细胞的早期活化至关重要。首先，团队在过继GFP-BDC2.5和CTO-NY8.3细胞过继入NOD-XCRvenus小鼠内，并使用多光子显微镜观察到pLN，而非iLN出现BDC2.5、NY8.3和cDC1的簇状分布，表明cDC1直接参与InsC-ChgA和IGRP的抗原提呈。其次，作者使用白喉毒素介导的NOD-XCRDTR小鼠清除cDC1，发现只影响3周而非10周小鼠pLN内CD4+T细胞的活化增殖。另外，清除cDC1导致pLN内内源性InsC-ChgA特异性T细胞比例降低11.7倍，而InsB特异性T细胞降低3倍。总之，这些数据表明胰岛特异性CD4+T细胞的活化需要pLN内XCR+cDC1的抗原提呈，且这个过程只在早期有重要作用。上述发现均不能解释InsC-ChgA和InsB特异性T细胞的差异致病能力，作者继续假设可能是T细胞内源性因素。团队使用胰岛肽特异性MHC-II tetramers分离10周NOD小鼠胰腺浸润的InsC-ChgA、InsC-IAPP、InsBp8E和InsB p8G相关CD4+T细胞并行scRNA-seq分析。结果发现12群tetramers+T细胞群，c2和c6表现为Th1特征（Ccl5、Nkg7、Ccl4、Cxcr6、Ccl4、Gzmk、Ccl3和Ifng）；c4表现为Treg特征（Foxp3、Ctla4和Il10）；c9表现为中央记忆性/初始细胞特征（Ccr7、Tcf7和Sell）；c1、c7和c8表现为Tfh特征；c11为无能（anergic）特征，表明胰腺浸润胰岛特异性T细胞的异质性。值得注意的是，将肽特异性匹配相应的亚群时，发现InsC-ChgA细胞主要分布在Th1的c2和c6群；InsBp8E分布在无能c11群；InsB p8G分布在Treg的c4群；InsC-IAPP分布在c0群， 表明InsC-ChgA特异性细胞倾向于Th1分化，而InsB特异性细胞倾向于Treg分化。后续流式分析同样证实相比于InsB+细胞，InsC-ChgA特异性细胞高表达CCL5而低表达LY6A/E；Treg+细胞在InsC-ChgA细胞群中的比例显著显著低于InsB+细胞，且即使均为Treg细胞，InsC-ChgA Treg细胞HELIOS的表达也远低于InsB Treg。最后，作者开发InsC-ChgA:IAg7特异性单克隆抗体1A1阻断TCR与InsC-ChgA的结合。体内实验发现1A1成功抑制InsC-ChgA特异性CD4+T细胞过继引起的糖尿病。另外，1A1也显著抑制NOD小鼠自发糖尿病。总之，这些数据指向InsC-ChgA特异性CD4+T细胞的致病作用。综上所述，这项研究揭示胰岛抗原特异性T细胞之间的致病等级，并强调胰岛素杂交肽（HIP）在糖尿病中诱导T细胞反应的异质性，为抗原特异性治疗减弱致病性CD4+T细胞提供可能性。原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.07.024
制版人：十一
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（*排名不分先后）
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