活细胞超分辨荧光显微成像技术的发展目标是在生理友好的成像条件下保持足够的时空分辨率。然而，提升空间分辨率通常需要增加照明强度或延长曝光时间，同时还需匹配时间分辨率以防止运动伪影，因此活细胞超分辨成像中光子效率的提升至关重要。深度神经网络利用监督学习拟合噪声图像与干净图像之间的映射，能够显著提升光子效率，然而其需要收集大量配对的干净图像，难以应用于活细胞。另一方面，无监督学习去噪方法给超分辨成像提升光子效率提供了另一种选择【1-9】，但仍需要大量的噪声图像对进行学习，去噪效果有限且数据效率低。因此，如何能在有限的数据下、在无需噪声图像对条件下，开发无监督学习去噪方法提升超分辨显微系统光子效率，实现活细胞超分辨尺度下长时程成像目标，仍是目前领域内的挑战。2024年9月11日，哈尔滨工业大学赵唯淞/李浩宇团队与北京大学赵士群/陈良怡团队合作在Nature Methods上在线发表论文Self-inspired learning for denoising live-cell super-resolution microscopy。他们提出一种基于无监督学习的自启发学习去噪方法（Self-inspired Noise2Noise, SN2N），首先利用超分辨系统的空间采样冗余特性设计自监督数据生成策略，从单张图像生成所需的噪声对图像作为数据集。同时开发自约束学习策略，进一步提高去噪性能和数据效率，仅使用单一噪声图像即可去噪，在无需大训练集和高信噪比真值图像的条件下，将光子效率提升了两个数量级，实现了在低光照条件下的温和、长时程活体成像。该技术在转盘共焦超分辨显微系统上成功观察到了超过三小时的五维（xyz-颜色-时间）有丝分裂完整过程，分辨率达到90nm。此外，该技术具有广泛的适用性，能够应用于各种超分辨显微成像系统，包括结构光显微镜（SIM）、受激辐射损耗显微镜（STED）、膨胀显微镜（ExM）、荧光涨落超分辨成像（SOFI），甚至可以应用于双光子钙信号成像中，为在超分辨尺度下研究细胞器互作原理及其他生物医学研究提供了新的科学影像工具。
研究者将SN2N方法，结合RL（Richardson-Lucy）解卷积技术提高分辨率，开发RL-SN2N方法，并应用于基于转盘共聚焦超分辨显微系统（Spinning Disk Confocal Structured Illumination Microscopy, SD-SIM），实现了清晰的四色活细胞成像（视频1）。SN2N使得快速而复杂的细胞器动态过程得以可视化，研究者进一步对不同细胞器的轨迹和空间分布进行详细记录，追踪多个细胞器之间的相互作用事件，深入探索细胞器之间的协同作用和相互作用关系。视频1 | SN2N在SD-SIM系统上的四色活细胞成像结果：线粒体(绿色)、内质网(灰色)、溶酶体(红色)、高尔基体(蓝色)。
2. 对比验证SN2N去噪优越性：四色活细胞超分辨成像
研究者还在上述SD-SIM四色活细胞成像数据上，将RL-SN2N与多种无监督去噪方法进行了对比，包括Noise2Void（N2V）【1】、 parametric probabilistic Noise2Void（PPN2V）【2】、Self2Self（S2S）【3】、Recorrupted2Recorrupted（R2R）【4】、Noise2Fast（N2F）【5】、DeepCAD【6】、DeepSeMi【7】和SRDTrans【8】。RL-SN2N能够清晰地解析亚细胞器尺度上不同细胞器的互作关系。相比之下，其他无监督去噪方法在这种超低信噪比条件下未能有效去除噪声，无法提供良好的数据去噪结果（图1）。这突显了RL-SN2N在极低信噪比成像数据处理中的显著优势。图1 | SN2N在SD-SIM四色活细胞数据上与其他无监督去噪方法的去噪效果对比。比例尺：1 µm。
研究团队还使用所开发的RL-SN2N方法在SD-SIM系统上成功实现了分辨率高达90纳米的五维（xyz-颜色-时间）长时程活细胞超分辨成像。该技术揭示了在整个细胞有丝分裂过程中内质网（洋红色）、线粒体（绿色）和细胞核（青色）之间的动态组学互作，监测时间超过3小时。通过RL-SN2N，研究者能够在超分辨尺度下清晰地观察到密集的内质网-线粒体网络的分离过程及其相互作用（视频2）。视频2 | SN2N实现五维长时程活细胞成像，记录有丝分裂完整过程。4. 应用举例：SN2N实现长时程活细胞STED成像研究者还将RL-SN2N应用于商用STED系统（Abberior Instruments STEDYCON），在低光照和短像素持续时间条件下进行成像。在这一设置下，RL-SN2N成功捕捉到了在线粒体（PK Mito Orange标记【9】）融合和分裂过程中复杂的嵴运动（图2），记录时间长达半小时，展示了自启发去噪方法在减少光漂白和维持高时间分辨率方面的有效性。图2 | SN2N允许长时程活细胞STED成像。a，低光照和短像素持续时间成像条件下的STED（左）和RL-SN2N（右）成像结果。b，a中白框区域的放大视图。c-d，线粒体融合（c）和分裂（d）的代表图像序列。黄色箭头和蓝色箭头分别标示线粒体融合和分裂的区域，白色箭头指示事件发生前的时刻。比例尺：500 nm（a-d）。为了提高SOFI重建的效率，研究者将SN2N方法整合到SOFI重建流程中（SOFI-SN2N）。具体而言，原始图像序列首先计算n阶累积量，然后对这些图像应用RL-SN2N处理。研究者在活细胞实验中验证了二阶SOFI-SN2N的效果。结果显示，与传统20帧SOFI图像相比，二阶SOFI-SN2N显著减少了明显的雪花状伪影，能够从仅20帧图像中获得无伪影的结果，并成功记录了线粒体在10分钟内融合过程中线粒体外膜的动态精细变化（图3）。
图3 | SOFI-SN2N在活细胞中高效重建SOFI。a, 基于SD-confocal显微系统的COS-7活细胞SOFI-20f成像及其SN2N结果。b，线粒体外模结构的放大视图。前三行，从上到下依次为：SD-confocal图像、二阶SOFI 20f重建结果和二阶SOFI-SN2N 20f结果；后三行为一个代表性的线粒体分裂事件。黄色箭头和白色箭头分别指示了线粒体分裂和分裂前的状态。比例尺：2 µm（a, b）。6. 应用举例：双光子钙离子成像验证SN2N线性响应针对钙离子成像这一具有时间冗余特性的数据，SN2N流程中也纳入了时间交错采样【6】策略（SN2N（temporal）），以在实现优异空间去噪效果的同时更好地维持时间信号稳定性。利用双光子显微镜数据对快速钙离子瞬变进行去噪，研究者验证了SN2N的线性响应。结果表明，SN2N在处理不同钙离子瞬变幅度时未出现非线性扰动，定量分析显示其去噪过程具有较高的准确性，具有更优的时空去噪能力（图4）。
图4 | 使用双光子显微镜数据验证SN2N线性响应。a, 从左到右：低信噪比的双光子钙离子数据、SN2N（时间重采样）去噪结果，以及高信噪比双光子钙离子数据（十倍成像信噪比）。底行显示了白框区域的放大视图。b，从a中黄色框区域提取的沿时间轴的荧光轨迹曲线。轨迹的Pearson相关系数（r）标记在右下角。比例尺：50 µm（a）。形象地说，SN2N技术就像一面神奇的镜子，通过自我反射和自我启发，将模糊的图像转化为清晰的图景，把那些难以辨识的生物信息逐渐呈现出来。它就像一位出色的解密者，能够将隐藏在迷雾中的生物世界的秘密一一揭示。SN2N巧妙地利用了超分辨率显微成像系统的物理特性，无需大量匹配图像的辅助，使得活细胞温和、长时程的超分辨成像成为现实。哈尔滨工业大学博士研究生曲丽颖为论文的第一作者，论文共同第一作者还包括北京大学赵士群副研究员和哈尔滨工业大学博士研究生黄园园。哈尔滨工业大学仪器学院赵唯淞教授为论文的通讯作者；哈尔滨工业大学李浩宇教授、谭久彬院士，北京大学陈良怡教授为论文的共同作者。
赵唯淞，哈尔滨工业大学仪器科学与工程学院，教授/博导，获国家基金委优青项目资助。主要从事生物医学显微成像技术的研究，聚焦于超分辨显微镜、计算成像、机器学习、生物信息学等。以第一/通讯（共）作者身份在Nature Biotechnology、Nature Photonics、Nature Methods等期刊发表学术论文。长期担任Nature Methods、Nature Photonics等期刊审稿人。课题组资金充沛，与国内外多家顶级科研院所均有合作，目前招收仪器、光学（物理）、计算机、电子工程、生物医学工程等专业研究生，博士后1人（有生物荧光显微成像、计算机视觉背景优先）。有意者请投递简历，一起探索下一代生物医学成像与分析新技术。课题组中文主页：http://homepage.hit.edu.cn/weisongzhao英文主页 ：https://weisongzhao.github.io/home/https://jinshuju.net/f/ZqXwZt或扫描二维码投递简历https://doi.org/10.1038/s41592-024-02400-9制版人：十一
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