ω-氨基酸与内酰胺的生物合成研究进展

synbio深波 · 公众号 · · 2025-02-23 20:43

正文

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以可再生碳资源为原料，以工程微生物为核心工具，通过生物制造的方式生产生物基材料等化学品，具有绿色、低碳的优势，已经成为目前研究的热点。 ω-氨基酸 是氨基和羧基分别位于支链碳链两端的一种非天然氨基酸，其自身环化的产物内酰胺 是合成聚酰胺材料（又名尼龙）的关键单体 。聚酰胺材料具有广泛的应用与巨大的市场，目前主要通过石化路线生产，生物合成路线仍处于研究阶段，但是近年来进展迅速。本文系统介绍了ω-氨基酸与内酰胺的生物合成研究进展。为合成生物基聚酰胺材料，研究者设计了ω-氨基酸的人工合成途径，挖掘了可环化ω-氨基酸合成内酰胺的关键酶，通过在微生物底盘细胞中组装合成途径，调控和优化代谢流量，开发内酰胺生物传感器并进行高通量筛选，实现了C4~C6的ω-氨基酸和内酰胺的生物合成。尤其以葡萄糖为原料合成戊内酰胺的产量超过70 g/L，生产强度达到约1 g/(L·h)，接近可工业化的水平。最后，本文也讨论了目前ω-氨基酸与内酰胺生物合成面临的途径原子经济性低、关键环化酶限速、一碳等非粮原料开发利用不足等挑战。

研究正文

内酰胺（lactam）是由非天然的直链氨基酸（也称ω-氨基酸）环化后形成的一类重要化学品。这类化合物开环后通过酰胺键（—CO—NH—）聚合形成一类线性的高分子材料——聚酰胺（polyamide，PA）。PA以其独特的性能而闻名，包括高抗拉强度、电绝缘、耐热、耐磨、生物相容性好等。这些特性使得PA在汽车、电气、纺织和医疗等行业应用广泛。自1938年首款以尼龙（nylon）为名的聚酰胺材料产品面世以来，聚酰胺材料的市场规模不断扩大，目前的全球年产量已达700万吨。由6-氨基己酸（6-aminocaproic acid，6-ACA）环化形成的己内酰胺（caprolactam）是合成尼龙-6的原料，全球年产量超过440万吨，市场规模估计为150亿美元。除了己内酰胺，一些碳链较短的内酰胺也具有特殊的应用。由5-氨基戊酸（5-aminovaleric acid，5-AVA）环化形成的戊内酰胺（valerolactam）可用于合成尼龙-5和尼龙-6,5这两种具有独特性能的聚酰胺材料。由γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）环化形成的丁内酰胺（butyrolactam）可用于合成尼龙-4，这种材料具有更好的热稳定性、更高生物降解性与疏水性。除此之外，丁内酰胺还是生产N-乙烯基吡咯烷酮的前体，后者是注射剂、药品生产、膜过滤器、地板抛光剂等的溶剂。

目前工业化内酰胺的生产主要依靠石油化工衍生路线，反应条件苛刻，反应工艺复杂，不利于生态环境保护。随着国际社会对气候、环境、资源等问题的关注度越来越高，传统的化学工业正向着可再生和可持续的方式转变。利用改造的微生物为催化剂，以可再生资源为原料，通过生物催化或生物发酵的方式，已经可以实现在温和的反应条件下合成一些高价值、具有高对映体选择性的化学物质，从而绕过条件苛刻和不可再生的传统化学合成过程。生物基PA材料更具有可持续性和环保性，符合绿色、低碳、可持续的发展要求。 为实现PA材料的绿色可持续生产，内酰胺及其前体ω-氨基酸的生物合成也成为了近年的研究热点。

由于大部分微生物体内不存在天然的ω-氨基酸和内酰胺合成途径，需要引入异源的基因或代谢途径，构建ω-氨基酸和内酰胺的生物合成菌种。现有研究表明，部分ω-氨基酸和内酰胺可以以蛋白质氨基酸（如L-谷氨酸和L-赖氨酸）为前体，经过人工组装的代谢途径转化为ω-氨基酸和内酰胺。目前大部分蛋白质氨基酸已经实现了生物发酵工业生产，L-赖氨酸和L-谷氨酸的发酵产量均已超过200 g/L，这为ω-氨基酸和内酰胺的生物合成奠定了基础。本文首先简单介绍以石化资源化学合成内酰胺的传统路线，然后重点综述了ω-氨基酸和内酰胺的生物合成研究进展，以及基于生物传感器的高通量筛选方法和动态调控策略在内酰胺合成菌种优化中的应用，最后对使用木质纤维素原料、一碳原料等非粮原料进行聚酰胺材料单体合成的前景进行展望。

1 内酰胺的化学合成方法

目前，内酰胺主要由石化原料合成。例如，己内酰胺的生产以苯或苯酚的衍生产物环己酮为原料，首先使用硫酸羟胺将环己酮转化为环己酮肟，然后在90~120 ℃的高温和硫酸条件下，通过Beckmann重排反应将肟分子转化为己内酰胺（图1）。己内酰胺的后续分离纯化需要添加NH3，因此每生产1.0 kg的己内酰胺就会产生1.8~5.0 kg的硫酸铵废物。通过一些绿色化学工艺可减少硫酸铵废物，但整个反应过程仍然需要高温和酸性的反应条件。目前，丁内酰胺的工业生产以1,4-丁二醇为原料，首先通过脱氢反应生成丁内酯，后者与氨反应生成丁内酰胺（图1）。由此可见，目前内酰胺的生产主要依赖石化原料，生产工艺耗能较高，且需要高温、酸性等反应条件。

图1 以石化资源化学合成内酰胺和聚酰胺的路线

2 内酰胺的生物合成方法

内酰胺生物合成方法主要是先合成非天然的直链ω-氨基酸，后者自身环化后形成内酰胺。 已实现生物合成的ω-氨基酸主要有三类，分别是GABA、5-AVA和6-ACA ，三种ω-氨基酸的生物合成途径如图2所示。下面将就三种ω-氨基酸的生物合成研究进展进行详细的介绍。

2.1 γ-氨基丁酸及丁内酰胺的生物合成

2.1.1 谷氨酸生物转化法

GABA是一种四碳的非蛋白质氨基酸，广泛应用于食品、饲料和医疗等领域，被列入美国能源部的“生物质高附加值化学品”名单。GABA生物合成主要通过L-谷氨酸的不可逆α-脱羧反应实现，该过程由吡哆醛5′-磷酸依赖性的L-谷氨酸脱羧酶（L-glutamate decarboxylase，GAD）催化（图2）。目前GABA的生物合成方法主要有生物催化法和生物发酵法（表1）。

图2 ω-氨基酸的生物合成途径

aspC—编码天冬氨酸转氨酶；lysC—编码天冬氨酸激酶；dapA—编码二氢二吡啶合酶；dapB—编码4-羟基四氢二吡啶还原酶；ddh—编码内消旋二氨基庚二酸-脱氢酶；lysA—编码二氨基庚酸脱羧酶；davA—编码5-氨基戊酰胺水解酶；davB—编码赖氨酸单加氧酶；patD—编码γ-氨基丁醛脱氢酶；ldcC—编码赖氨酸脱羧酶；cadA—编码赖氨酸脱羧酶；patA—编码丁二胺氨基转移酶；puuA/ygjG—编码丁二胺转氨酶；lysOx/RaiP—编码赖氨酸α-氧化酶；kivD—编码2-酮异戊酸脱羧酶；padA—编码苯乙醛脱氢酶；nifV—编码高柠檬酸合酶；kdcA—编码酮酸脱羧酶；vfl—编码氨基转氨酶；argA—编码氨基酸乙酰转移酶；argB—编码乙酰谷氨酸激酶；argC—编码N-乙酰基-谷氨酰-磷酸还原酶；argD—编码乙酰鸟氨酸转氨酶；argE—编码乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶；argJ—编码鸟氨酸乙酰转移酶；speC/speF—编码鸟氨酸脱羧酶；gadB—编码谷氨酸脱羧酶β亚基；gadA—编码谷氨酸脱羧酶α亚基；leuA—编码α-异丙基苹果酸合成酶；leuB—编码3-异丙基苹果酸脱氢酶；leuCD—编码3-异丙基苹果酸脱水酶；aksD—编码异丙基苹果酸脱水酶大亚基；aksE—编码异丙基苹果酸脱水酶小亚基；aksF—编码异丙基苹果酸/高异柠檬酸脱氢酶

表1 γ-氨基丁酸的生物合成

生物催化法通过表达不同来源的GAD，将前体L-谷氨酸转变为GABA。生物催化法的关键是从不同微生物中克隆性能优异的GAD，并在一些模式微生物，如大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中进行异源表达。目前已经从大肠杆菌、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、堀越火球菌（Pyrococcus horikoshii）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）等微生物中克隆了GAD，对这些GAD的酶学性质进行了详细的表征，并应用于GABA的生物催化合成。Ke等在大肠杆菌BW25113 ΔgabAB中过表达来自外源乳杆菌中的gadB基因编码的GAD，以L-谷氨酸为底物进行全细胞催化，在不添加辅因子吡哆醛5'-磷酸（PLP）的情况下，添加3 mol/L L-谷氨酸底物时GABA产量达到308.96 g/L；该菌株在添加2 mol/L L-谷氨酸底物中可重复使用三个周期，总GABA产量达到614.15 g/L。由于催化效率高，产物产量高，全细胞生物催化是GABA工业生产的有效策略之一。

2.1.2 从头发酵合成法

一些从发酵产品中分离的乳酸菌（LAB）天然能够产生GABA，例如从泡菜、奶酪、酸奶等中分离的乳杆菌和乳球菌。这些菌株中的GAD活性较高，具有较强的GABA产生能力。Li等从我国泡菜中分离了一株短乳杆菌（Lactobacillus brevis）NCL912菌种，利用该菌株在以L-谷氨酸钠为底物的丰富培养基中发酵，最终GABA的产量达到了103.7 g/L。Wang等同样利用该菌株，通过进一步优化培养条件，以L-谷氨酸为底物，最终在10 L反应器中GABA产量达到了205.8 g/L。除LAB外，研究者们从富含GABA的食品中分离出的其他微生物，也具有一定的GABA生产能力，例如紫红曲霉（Monascus purpureus）、小孢根霉（Rhizopus microspores）和唾液链球菌（Streptococcus salivarius）等菌株。但是这些菌株的GABA生产能力相对于LAB较低，通过进一步的代谢改造，有望提升这些菌株的生产能力。

虽然对于天然产GABA菌株的研究取得了一定的进展，但是这些菌株仍需要在培养基中直接添加L-谷氨酸进行发酵，以及添加大量其他的氮源，这限制了GABA的大规模生产。因此，近些年利用工程菌株一步发酵葡萄糖产GABA引起了研究者的广泛关注。 目前主要利用代谢工程技术改造大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌一步发酵法生产GABA。 Pham等在大肠杆菌中利用蛋白支架将异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸合酶和GAD串联在一起，在以葡萄糖为碳源的培养基中GABA产量达到了1.3 g/L。尽管利用重组大肠杆菌产GABA的浓度相对较低，但是以上研究为GABA合成提供了一种新的思路。谷氨酸棒杆菌因其出色的谷氨酸合成能力而被认为是生产GABA的理想菌株。Choi等将来源于大肠杆菌的GAD突变体GADGlu89Gln/Δ452-466克隆至谷氨酸棒杆菌中，通过优化GAD突变体的表达元件和发酵条件，GABA的产量达到了38.6 g/L。Zhang等在谷氨酸棒杆菌中开发出了一种不需要额外添加辅因子吡哆醛5′-磷酸，直接发酵葡萄糖产GABA的高效方法，通过两阶段的pH控制策略，发酵72 h后GABA产量达到了70.6 g/L。Baritugo通过在一株高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌KCTC 1852中引入木糖的利用途径和GABA合成途径，以葡萄糖和木糖为混合碳源，最终GABA的产量达到了35.47 g/L。Zhang等在谷氨酸棒杆菌中重构三羧酸（TCA）循环，增强乙酰辅酶A（CoA）生成α-酮戊二酸，进而增加向GABA直接前体物质L-谷氨酸的合成通量，并阻断了GABA分解代谢，增强运输系统，进一步提高了GABA的合成，以葡萄糖为碳源发酵，GABA产量为23.07 g/L；此外，还构建了乙酰辅酶A依赖的丁内酰胺生物合成途径，丁内酰胺产量为4.58 g/L。

虽然工程微生物生产GABA已经取得了一定的进展，但 要进一步提高GABA的产量和转化率，以满足工业化生产的要求，还需要解决两个问题。 首先，大多数细菌来源的GAD仅在酸性条件下具有活性，而在中性pH下失去酶活性，这严重限制了它们在GABA发酵生产中的应用。尽管通过定向进化获得了一些pH范围扩大的GAD突变体，但它们在近中性pH下的活性仍然很低。其次，α-酮戊二酸是GABA生物合成的重要前体，但该代谢物也是TCA循环的中间体，主要负责在有氧条件下为细胞生长提供能量和物质。因此，过量的代谢通量进入GABA生物合成途径不可避免地引起细胞生长和GABA生产之间的竞争，从而损害细胞活力和途径生产能力。如何平衡产物合成和细胞生长的关系是提升GABA生物合成的关键限制因素。Wei等利用途径工程技术在谷氨酸棒杆菌中优化了甘油的利用途径，提高了甘油的利用效率，同时引入GABA的生物合成途径，为了进一步平衡细胞生长和GABA合成的碳流，构建了可调的生长依赖型双功能的遗传开关，利用该调控技术重构了GABA合成代谢网络，工程菌株能够在积累足量的生物量之后发生代谢状态转变，使细胞代谢状态由“生长模式”向“生产模式”转变，从而实现了细胞生长和产物合成的协同平衡。最终构建的工程菌株GABA产量为45.6 g/L，产率提升至0.4 g/g甘油，是目前报道的利用甘油生产GABA的最高产量，为谷氨酸棒杆菌细胞工厂的代谢调控提供了新的工具和方法。

在实现GABA高效的生物合成后，研究者进一步提升了丁内酰胺的合成水平。Zhang等在大肠杆菌中表达GAD突变体GadB_ΔHT和环化合酶MBP-ORF26（与麦芽糖结合蛋白融合的酰基CoA连接酶）构建丁内酰胺合成途径，在补充9 g/L L-谷氨酸培养基中发酵得到1.1 g/L丁内酰胺。Chae等在大肠杆菌中过表达GaD突变体（GadB E89Q Δ452-466）、ω-氨基酸环化酶β-丙氨酸CoA转移酶（Act），构建了丁内酰胺代谢途径，以葡萄糖为碳源补料分批发酵，丁内酰胺的产量可达到54.14 g/L。

ω-氨基酸与内酰胺的生物合成研究进展

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