circRNA的研究发的文章其实普遍都不会特别高，今天讲的这篇文章，就是中山大学附属第三医院胡昔权团队的博士和博后，发表在14.3分的Adv Sci (Weinh)上的文章。他们研究的领域挺有意思，是运动介导的神经保护，但这里的机制，他们做的是circRNA，我们就一起来看看他们做了些什么吧：
他们首先通过诱导小鼠的短暂性MCAO（大脑中动脉闭塞） 建立了中风小鼠的模型，然后通过分析了运动后，对小鼠的MCAO的影响。结果发现运动有效减轻了MCAO中风小鼠的神经功能障碍。小胶质细胞/巨噬细胞在神经炎症中的核心作用，对于神经功能障碍也很重要，于是他们进一步分析了运动对半影内小胶质细胞/巨噬细胞活化的影响。他们发现运动后，巨噬细胞趋向于表达Arg1，而非CD68，也就是说运动可以使巨噬细胞偏向于M2极化，抑制炎症。同时他们分析了小胶质细胞/巨噬细胞中的炎性小体NLRP3，以及相关的蛋白（NLRP3形成的炎性小体，可以通过结合Caspase影响造成IL1β的水解，并且将GSDMD水解成N端，造成细胞焦亡，不清楚的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列焦亡的那几章）。结果发现，运动有效减轻了MCAO小鼠的神经炎症，和小胶质细胞/巨噬细胞的焦亡：
接着他们想要分析的是，在这个运动减轻神经细胞功能障碍的过程中，circRNA是否起到做用。于是他们进行了circRNA的测序分析（下面的热图，大家应该都能看懂了吧，就是通过热图展示转录本表达差异的，不清楚的话，可以去看看《夏老师带你读文献》），在这中间，他们找到了circFndc3b。OGD/R（氧聚糖剥夺和再氧合）后，circFndc3b表达会显著降低，但运动会诱导小鼠在MCAO后梗死周围皮层中，小胶质细胞/巨噬细胞的circFndc3b表达增加：
为了确定circFndc3b的具体功能，他们进一步对circFndc3b进行了敲减，特异性敲减了小胶质细胞/巨噬细胞的circFndc3b后，部分逆转了MCAO后运动的神经保护作用（这也就是柯霍氏法则的验证方法，通过移除circFndc3b后，所产生的功能表型的变化，来分析circFndc3b对于表型及机制有可能产生的影响，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》）。敲减了circFndc3b后，MCAO小鼠的半影皮层分离的小胶质细胞/巨噬细胞中NLRP3 、ASC 、Casp1 、IL18 、IL1β和GSDMD-N的表达上调。也就是说，特异性敲减了小胶质细胞/巨噬细胞的circFndc3b，会损害运动诱导的神经保护和抗焦亡作用：
既然敲减了circFndc3b会产生影响，那么在MG（原代小胶质细胞）中，过表达circFndc3b会产生什么影响呢？他们首先做了在MG中进行OGD/R处理的模型，以此体外模拟MCAO，观察到细胞死亡显著增加。而在在MG的OGD/R模型中，过表达circFndc3b可减轻OGD/R后NLRP3炎性小体介导的焦亡：
通过这两组实验，他们首先确定了circFndc3b对于运动诱导的MCAO神经功能障碍，有一定的贡献。但关键还是要找到circFndc3b具体的机制，他们首先分析了circFndc3b宿主基因Fndc3b的表达。结果发现Fndc3b的表达并不会随着敲减或过表达circFndc3b受到影响，也就是说Fndc3b对circFndc3b的功能并没有什么贡献。为了确定circFndc3b具体的机制，他们假设circFndc3b可能是通过与蛋白结合导致的（这一步就是通过对于circFndc3b的已知功能，以及对于circRNA的可能作用机制，提出的一个假设的迭代，通过这样的假设迭代，才能进一步推进课题，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》）。通过RNA Pulldown，他们发现circFndc3b可以与ENO1蛋白相互作用，而circFndc3b的过表达和敲低，均不影响小胶质细胞中ENO1的mRNA或蛋白表达水平：
那么circFndc3b具体影响的下游基因是什么呢？为了明确这一点，他们又通过分析敲减circFndc3b后的二代测序数据，找到了差异表达基因。在这些差异基因中，他们通过取交集又筛选了ENO1的靶基因，他们筛选到的潜在靶基因是Egr3和Klf2，而随着circFndc3b的过表达，Klf2蛋白水平显着增加，这一现象被ENO1敲低逆转，于是他们就选定了Klf2作为潜在的ENO1的靶基因。circFndc3b在这里起到了支架的作用，通过与ENO1的相互作用，促进Klf2的mRNA稳定性和蛋白质表达：
接着，就是将Klf2引入到原有的circFndc3b对于MCAO的小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的过程中。这里他们使用的是对于Klf2的敲减进行验证，但这一步如果只是通过敲减Klf2的话，就显得并不是那么严谨了（由于原有的命题是“circFndc3b通过与ENO1的相互作用，促进Klf2的mRNA稳定性和蛋白质表达，影响了细胞焦亡的表型”，这个命题的关键，并不在于Klf2的表达情况，而是“circFndc3b通过与ENO1的相互作用”，也就是说，更合理的验证，不是直接敲减Klf2，而是通过阻遏circFndc3b与ENO1的结合，来影响Klf2的表达，否则就会产生肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题的外延和内涵，以及所造成的肯定后件的逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。虽然这里得到了验证，小胶质细胞/巨噬细胞的KIf2以circFndc3b依赖性方式，介导MCAO后运动的神经保护作用，但实际上并不严谨：
接着他们以之前的研究作为基础，也就是circFndc3b在心肌梗死中下调FUS表达中的作用，然后引入了circFndc3b与ENO1结合，稳定mRNA这个潜在机制。来分析circFndc3b对于FUS的影响，是否是通过ENO1结合造成的。这里的验证其实和之前差不多，并没有什么可以借鉴的地方。由于FUS又是一种影响circRNA环化的蛋白，于是他们又进一步分析了FUS对于circFndc3b环化的作用。结果发现，circFndc3b通过与ENO1蛋白结合来稳定FUS的mRNA，而FUS又能调控circFndc3b的环化，算是完成了一个正反馈了：
这篇文章，在前期的推理和验证过程中，其实都没什么问题，但后期对于circRNA与ENO1的结合导致了下游基因表达的变化，还是有些草率的。单纯的敲减和过表达，并不能体现出这是由于circRNA与ENO1的结合所影响的，这就会造成肯定后件的逻辑谬误（不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。使得整个课题在机制方面，显得不够严谨。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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