三维肿瘤球的培养以及在肿瘤体外研究中的应用
李梦莹，吕慧侠*
（中国药科大学药剂学教研室，江苏 南京 210009）
[ 摘要] 与单层平面培养的肿瘤细胞相比，三维肿瘤球可以更好地模拟肿瘤细胞之间以及细胞外基质间信号转导的微环境，近年来被广泛用于肿瘤细胞形态学的研究、肿瘤干细胞的富集以及抗癌药物高通量筛选等方面，是肿瘤研究领域最好的体外模型之一。综述三维肿瘤球的构建以及在肿瘤体外研究中的应用。
[ 关键词] 肿瘤球；悬滴法；药物筛选
美国癌症学会（American Cancer Society，ACS）于2017 年1 月5 日对癌症的发病率、死亡率和生存率做了全面的最新年度报告，指出癌症死亡率近20 年来持续降低（从1991 年到2014 年，癌症死亡率下降了25%），但癌症仍是导致患者死亡的重大疾病，与癌症的抗争远没有结束。目前肿瘤治疗手段主要以常规手术辅助放化疗为主，然而由于治疗手段的局限性，总体治疗效果较差，因此探究肿瘤形成机制并针对性地开发新型抗癌药物成为当下研究的热点。在抗癌药物进行临床实验之前，必须经过严格的体外测试，确保其有效性和安全性。临床前研究的第一步便是体外细胞实验。目前，大多数肿瘤体外细胞实验使用的仍是传统的单层平面培养的肿瘤细胞。单层平面培养法为肿瘤细胞的生长提供一个可控的、均一的环境，并且有利于后续的显微分析和更换培养介质，但是这种传统的二维培养法未考虑到肿瘤体内的微环境和细胞之间的相互作用，与肿瘤实际的生长环境相距甚远。因此，研究者们尝试采用三维肿瘤细胞培养技术模拟体内环境，以减少体内外实验的差异。
肿瘤球(tumor spheroid) 是肿瘤细胞在无血清的培养条件下经表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF) 和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowth factor, bFGF）等多种细胞生长因子诱导形成的悬浮生长的细胞团块。肿瘤球的直径超过400 μm，由不断增生的外层细胞和由于氧气和营养物质传输的限制而处于静止期的内层细胞构成。三维培养的细胞培养媒介或平台有支架、水凝胶、微流体等，这些媒介与传统二维培养模式相比拥有优越的机械性能。肿瘤球用于肿瘤方面的研究已有40 余年，被公认为肿瘤研究最好的细胞模型之一。与传统的单层平面培养的肿瘤细胞相比，肿瘤球的三维空间结构可以为体外生长的肿瘤细胞提供类似体内生长环境的生物支撑或基质，并建立细胞之间及细胞与细胞外基质间相互联系。传统的单层平面培养的肿瘤细胞则由于结构过于简单，缺乏合适的生理学载体和结构力学特性，与体内正常生长的细胞相距甚远。因此，在肿瘤的侵袭、转移的体外研究和药物的高通量筛选方面，肿瘤球已经逐步代替平面培养的肿瘤细胞成为肿瘤体外研究中常用的模型之一。
1 肿瘤球的培养方法
由于可以直观地反映细胞间以及细胞与胞外基质间的相互作用，细胞球体的培养逐渐成为体外研究肿瘤的有力工具。肿瘤的三维培养除了经典的无血清悬浮培养、悬滴法等，近年来又开发了许多新的培养手段，这些培养方法克服了传统培养法的缺陷，操作简便，缩短了研究周期，可重复性强。下面简单介绍几种肿瘤球的三维培养方法。
1.1 悬浮培养法
悬浮培养法是肿瘤球培养的经典方法之一，利用含有多种细胞生长因子的无血清液体培养基悬浮培养肿瘤细胞形成不贴壁生长的肿瘤球。该方法操作简单，不需要特殊设备，成本较低，并且随着生物反应器技术的不断发展，悬浮培养法将成为大批量生产肿瘤球的常用方法之一。但是悬浮培养法培养肿瘤球的周期较长，需要控制接种的密度，否则无法精准控制肿瘤球尺寸的均一性，不利于实际的应用研究。例如，Qiu等按每毫升105 个的密度将处于对数生长期的小细胞肺癌细胞系接种于内含20 μg · L-1 EGF 和bFGF 的无血清DMEM/F12 培养基中，于37 ℃，5% CO2 的恒温培养箱中培养，并且根据细胞的生长速度和培养液的颜色变化定期更换培养液，2 周后得到肿瘤球并进行传代培养。
1.2 悬滴法
悬滴法是三维培养肿瘤球的常用方法之一。将附有细胞悬液液滴的平板反向，肿瘤细胞将自发聚集在液滴的底部形成球体。该法不需要特定的仪器设备，依靠表面张力促进肿瘤细胞的生长增殖。但是传统的液体悬滴法由于蒸发作用的存在很难长时间维持细胞培养的微环境，并且肿瘤球体的分离和纯化也存在一定困难。悬滴法形成的肿瘤球体需要抽取，然后需转接入其他培养装置中进行灌注培养。悬滴列阵平板法对传统悬滴法进行了改进，其具有高流通量的液体处理系统，弥补了传统悬滴法的不足，采用96 孔或384 孔板培养可以形成尺寸更小的肿瘤细胞聚集体，更加精准地控制肿瘤球的尺寸。最近，Leung 等 证明采用悬滴阵列平板法培养的细胞球体具有更好的循环性和紧密度。Hsiao等 创造了一种新型的384 孔的悬滴列阵平板法用于药物的高通量筛选，很好地避免了机械搅拌产生的不稳定因素。
1.3 微流控芯片
微流控芯片技术是一种新型的培养方法，起步较晚，但已成为目前肿瘤球三维培养的研究热点。微流控芯片通常由聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG) 或聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）制成通道，在极小而密闭的空间内完成对肿瘤体尺寸的精确控制。这种培养方法可用于单个肿瘤球的培养、观测和分析，有利于肿瘤细胞生理学的研究和揭示肿瘤发生转移的规律。但是微流控芯片的制备是一项繁琐而复杂的工艺，制作成本高，限制了其广泛的应用。
Sun 等 利用PDMS 和玻璃制造了一种新型微流控芯片，细胞悬液可以很容易地被引入细胞培养微孔，并且可通过微流孔道实现与外部液体环境的物质交换。该方法设计巧妙，操作简便，适用于抗癌药物的筛选和细胞生物学的研究。
1.4 旋转培养法
旋转培养法是一种肿瘤球动态培养方法。该方法将细胞悬液置于旋转烧瓶、滚转试管或回旋振荡器内，在一定速度的旋转搅拌下，促进营养物质和代谢物的运输，防止细胞沉淀。例如美国NASA 设计的旋转细胞培养体系，成功实现了三维基质的相互作用，提供了具备物质运输静态的三维球状体培养的环境。然而，旋转培养法也存在一定的缺陷，例如其不适用于对剪切力敏感或低黏附性的细胞，并且持续搅拌不利于直观地观察细胞的聚集，此外旋转培养法的设备构造较为复杂，实现起来比较繁琐，这也限制了其广泛应用。
2 肿瘤球的应用
与单层平面培养的肿瘤细胞相比，三维肿瘤球可以更好地模拟肿瘤细胞之间以及细胞外基质间信号转导的微环境，广泛用于肿瘤细胞形态学的研究、肿瘤干细胞的富集以及抗癌药物高通量筛选等方面。
2.1 模拟肿瘤微环境
肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的复杂环境，包含一系列复杂的混合物，包括正常的上皮细胞、高度异质的恶性细胞、基质细胞和细胞外基质等，肿瘤微环境的成分和肿瘤细胞之间存在相互刺激作用，影响肿瘤细胞的增殖和转移。传统的二维单层平面培养的肿瘤细胞无法体现肿瘤生长、增殖、转移和入侵过程中肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与细胞外基质间的相互作用。此外，单层平面培养的肿瘤细胞通过细胞支架重新排列获得人造的细胞极性，造成了肿瘤细胞基因和蛋白质表达的异常。
与平面培养的肿瘤细胞相比，三维培养的肿瘤多细胞球体更能体现肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与细胞外基质间的相互作用，较好地复制实体瘤的组织结构，模拟肿瘤微环境。多项研究表明体外培养的肿瘤球和体内的实体瘤之间有许多相似之处。如肿瘤球内肿瘤细胞的生长速率，基因表达谱以及细胞进程中的增殖、沉默和坏死等行为都与实体瘤细胞相似。此外，与肿瘤体内微环境一样，三维培养的肿瘤多细胞聚集体也存在营养物质、气体和pH 的梯度表达现象。因此，多细胞肿瘤球作为肿瘤体外研究的模型，可以模拟体内肿瘤的微环境，用于肿瘤细胞形态学和肿瘤细胞入侵和迁移的行为研究。
2.2 富集肿瘤干细胞
肿瘤干细胞的数目稀少，且其组织定位和形态不明确，无法直接从肿瘤细胞中分离，因此无法在细胞层面上明确肿瘤干细胞的活动规律、功能及调控模式。近年来，有学者提出在无血清培养液中形成的肿瘤球具有干细胞特性，可用于富集肿瘤干细胞。在悬浮培养过程中，分化程度较高的细胞都会凋亡，而肿瘤干细胞具有失巢凋亡抗性，经EGF 和bFGF 等细胞生长因子诱导，可以形成悬浮生长的肿瘤球。此外，将数量稀少的肿瘤干细胞聚集在肿瘤球体中，可作为靶向药物作用的靶点，开发研究针对肿瘤干细胞的治疗药物。
Jiyong 等 从原始神经外胚瘤中分离出单个肿瘤细胞，然后用无血清悬浮的方法生成肿瘤球，通过免疫细胞化学验证肿瘤干细胞的表面标志物CD133，证明肿瘤球具有干细胞特性。
Michishita等 尝试利用犬乳腺癌的4 种细胞系培养肿瘤球，并考察肿瘤球的特性，发现干细胞相关基因CD133、Notch3 和MDR 的表达显著增加，从乳腺癌细胞系培养的肿瘤球显示出潜在的干细胞特性。
Qiu 等 从Ⅲ期脑胶质瘤中分离出单个肿瘤干细胞，并在体外培养成肿瘤球，用实时PCR 技术和免疫分析法比较干细胞和原代培养的胶质瘤细胞对免疫因子白细胞介素（IL）-10 和 人转移生长因子-b2（TGF-b2）的表达水平，发现肿瘤干细胞是免疫因子的主要来源，并且肿瘤干细胞在胶质瘤恶化上发挥决定性作用。
2.3 药物筛选
在临床前实验中，开发一种低价高效的体外肿瘤模型非常重要。目前，大多数的药物筛选仍使用单层细胞模型。单层细胞模型无法准确地模拟肿瘤体内的微环境，例如，单层平面培养的细胞在培养基上所获得的营养物质、氧气和pH 均相似，大多数细胞均匀生长并处于相同的细胞生长周期，无法体现实体瘤中由于基因表达和变异而产生的细胞表型的异质性。因此，采用单层平面培养的肿瘤细胞作为抗癌药物的体外模型时，所得到的实验结果和体内模型相比存在一定的差异，严重影响了药物体外筛选的效率。而三维肿瘤球模型中，其肿瘤细胞失去了极性，相互聚集构成了多细胞聚集体，与肿瘤体内的微环境更为接近，缩小了药物筛选的体外模型和体内模型的差距。此外三维肿瘤球聚体与动物移植实体瘤相比，具有重复性强、实验周期短、成本小等优点，同时可以避免动物实验的伦理道德问题。
Paola 等 发现用传统二维细胞模型筛选得到的抗胰腺癌药物在进行动物体内模型实验时存在严重的抗药性，于是他们构建了一种简单准确的高通量的三维肿瘤球模型，结果发现，与平面培养的肿瘤细胞相比，肿瘤球内细胞在缺氧的微环境下主要以糖酵解的方式进行代谢，并且基膜聚糖等基质蛋白和miRNA 的表达明显增加，一些在二维模型中抗癌效果较好且未产生抗药性的药物在肿瘤球模型中存在严重的药物抗性，这与在体内动物模型中得到的结果相似，而蒜素等在肿瘤球模型中抗癌效果较好的药物，在动物模型中也有较好的治疗效果。由此证明肿瘤球作为药物筛选的体外模型具有更高的准确性。
体外建立的三维肿瘤球体近年来已逐渐成为药物高通量筛选的一种有力工具。肿瘤球模型不仅可以在动物实验和临床实验之前排除疗效差的候选药物，而且可以重新鉴别在二维单细胞模型中测试失败的有潜力的药物。Ekaterina 等 用单层细胞模型、多细胞肿瘤球模型以及侵袭和转移模型考察临床批准或临床试用以及实验中的以金属为基本成分的抗癌药，如顺铂、镓(KP46)、钌(KP1339)、镧(KP772)等。用阿尔玛蓝检测试剂对比考察单层细胞模型和多层细胞模型的细胞毒性和细胞增殖，结果显示，以金属镓为基本成分的候选药物KP46 在多细胞肿瘤球模型中抑制突起形成的能力、成纤维细胞的侵袭性以及癌细胞的选择性能都明显增强。由此可以得出结论：肿瘤球模型用于药物筛选方面较其他模型而言具有独特的优势，可以更可靠地进行候选药物临床前评估调查以及预测新化合物的抗癌潜能。
2.4 药物传递系统评价
药物传递系统（drug delivery systems, DDS）是指按预期方式和速率释出药物并输送至特定部位的现代药物制剂。纳米粒是药物传递系统的重要组成部分，纳米技术是肿瘤转化研究中的重要工具，广泛用于肿瘤的诊断和治疗。纳米粒的制备材料、尺寸、表面电荷以及表面修饰都会直接影响其能否进入肿瘤细胞并发挥疗效。例如在纳米粒的研究中一直存在一个矛盾的问题即尺寸的大小：纳米粒的尺寸过大则其渗透肿瘤的能力较弱，而尺寸过小的纳米粒在肿瘤内的滞留能力较低。三维肿瘤球作为体外研究的有力工具用于考察纳米药物传递系统在肿瘤部位的渗透和滞留能力，可从2个方面评价纳米制剂传递系统：一是考察纳米粒和肿瘤细胞的相互作用，如与细胞结合，被细胞摄取以及在细胞中滞留；二是确定纳米粒在肿瘤间隙的扩散系数，考察纳米粒的渗透性。
Sagnella 等合成了醛基功能化的右旋糖苷和阿霉素的偶合物并将其制成纳米粒，对比游离药物和纳米粒在三维肿瘤球模型中的渗透性，发现阿霉素右旋糖苷纳米粒可以完全渗入肿瘤球，而游离的阿霉素仅能渗透50 μm 的距离，证明右旋糖苷纳米粒可作为阿霉素有效的传递载体。
Wientjes 等分别利用单层细胞模型和三维肿瘤球模型考察由不同比例的阳离子和膜融合脂质构成的脂质体与肿瘤细胞的相互作用以及脂质体的扩散性。在三维肿瘤球模型中，脂质体展现出在单层细胞模型中没有的二油酰磷脂酰乙醇胺（dioleoylphosphoethanolamine,DOPE）浓度依赖性特征，并且低浓度的DOPE 脂质体表面电荷的改变将影响其在瘤内的浓集。
3 结语
体外三维构建的肿瘤球模型可以准确地模拟肿瘤细胞间以及细胞外基质的微环境，广泛用于肿瘤形态学的研究、肿瘤干细胞的富集以及药物筛选等领域，成为体外实验最好的细胞模型之一。肿瘤球的培养方法也从最初的悬滴法、支架培养发展为先进的旋转培养、微流控芯片等。这些培养方法克服了经典方法的缺陷，缩短了研究时间，提高了模型的重现性。但是肿瘤球模型在实际的实验研究中仍存在许多问题，如操作繁琐、实验条件要求高等。因此肿瘤球模型的大规模应用仍需要进一步的研究和发展。
●感谢您阅读《药学进展》微信平台原创好文，也欢迎各位读者转载、引用。本文选自《药学进展》2017年第4期。
●《药学进展》是一本专注于医药领域前沿动态的专业媒体，月刊，铜版纸全彩印刷，全年360元，欢迎订阅！编辑部官网：www.cpupps.cn；电话：025-83271227。
● 由《药学进展》编委会主办的“第三届药学前沿高峰论坛”将于6月26日-28日在上海张江长荣桂冠酒店召开，诚挚相邀！
通讯地址：南京市童家巷24号（中国药科大学）《药学进展》编辑部
邮编：210009
联系电话：025-83271227
联系人：
