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Nature Chemistry
上的文章，题为：
Coacervate vesicles assembled by liquid-liquid phase separation improve delivery of biopharmaceuticals
。
该文章的通讯作者为浙江大学的顾臻教授、李洪军研究员和中国医科大学附属第一医院的刘福囝教授。
天然细胞中的囊泡通过磷脂层包裹功能物质，参与细胞内物质运输、代谢和储存。然而，脂质膜的低通透性和物理屏障对生物制剂的包装和功能化提出了挑战，影响了其在疾病治疗和药物递送中的应用效率。近年来，无膜结构的凝聚体作为一种新型的生物分子凝聚态，因其在生命起源中的关键作用以及在生物制药递送中的潜力而受到关注。这些凝聚体通过液
-
液相分离（
liquid-liquid phase separation, LLPS
）形成，易于跨膜递送，高效运载治疗药物并维持其生物活性。然而，传统的凝聚体存在稳定性差的问题，限制了其在长期储存和给药中的应用。因此，开发一种具有更高稳定性和递送效率的凝聚体递药平台对于提升生物制药的治疗效果具有重要意义。
本文中，作者利用胆固醇修饰的单链
DNA
（
Chol-ssDNA
）和组蛋白（
Histone
）间的相互作用构建了一种无膜囊泡状凝聚体，高密度的液体层包裹
和稳定内部的生物活性物质
，提高体内外的递送效率，如图
1
所示。
图
1.
用于生物制药递送的凝聚体囊泡的构建
作者首先开始探究
Chol-ssDNA
和组蛋白是否可以发生相分离。结果发现，二者的比例与浓度不同时会出现不同的状态，分别为均匀溶液（
SOL
）、凝聚体滴液（
COA
）以及具有低密度腔室的凝聚体囊泡（
CV
），其中当组蛋白浓度≥
0.25 mM
、
Chol-ssDNA
浓度
>1 µM
且组蛋白与
Chol-ssDNA
的比例大于
20
时，能够形成具有水相腔室和高密度外壳的囊泡状凝聚体。作者通过三维重建、荧光强度分析和扫描电子显微镜确定了
CV
的结构及高密度外壳为
Chol-ssDNA
和组蛋白层
。
CV
的粒径为微米级别，与纳米级别的载体相比，在细胞摄取和药物递送中可能表现出更好的性能。与
COV
相比，
CV
的凝聚度更低，具有更高的稳定性。如图
2
所示。
图
2.
胆固醇修饰的单链
DNA
和组蛋白形成的囊泡状凝聚体的表征
接下来，作者对
CV
的
LLPS
特性进行了研究。
CV
在光漂白后荧光恢复时间较长，表明其分子动态性较低，这可能是由于
CV
的囊泡结构限制了分子的运动。且
CV
在观察期间不会发生融合，
杨氏模量介于
COV
和不规则聚集中间，具有
稳定性
。且
CV
在
一定
温度、
pH
值和盐浓度
范围下也
表现出
了
良好的稳定性
。对比不同比例的
Histone/
Chol-ssDNA
下的
zeta
电位
和凝聚体形态可以发现
CV
在
zeta
电位
为正的
条件下形成
，具有
电荷依赖性。
作者又利用
CV
成功负载了腺病毒（
ad11
）、
双链
DNA
、
mRNA
、肽
LTX-315
和细胞因子
IL-2
等
多种物质
，并以
ad11-GFP
、
LTX-315
为例证明
CV
负载可以维持货物的生物活性。如图
3
所示。
图
3.
囊泡状凝聚体的物理化学性质
利用
CV
装载腺病毒得到
ad11-CV
。通过共定位实验、
SEM
、
TEM
证实
ad11
在
CV
的高密度外壳中均匀分布
后，作者又探究了
ad11-CV
的稳定性，
48 h
后几乎不发生融合，混合物依旧浑浊，相对浊度为
0.69
。
如图
4
所示。
图
4.
囊泡状凝聚体对溶瘤腺病毒的负载
作者又探究了
CV
装载是否可以促进
ad11
的细胞摄取。无论
TC-1
细胞表面是否过度表达病毒结合受体
CD46
，
ad11-CV
组
ad11
进入细胞的效率都高于未被包裹的
ad11
和
COA
包裹的
ad11
，在其他多个细胞系中也同样观察到了
ad11
被
CV
包裹后细胞内化效率的增加，这可能与
ad11-CV
的相对稳定性和表面正电荷有关。作者进一步探讨了
ad11-CV
的内化机制。发现能量抑制剂
2-DG
抑制了
ad11-CV
的内化，说明
CV
的内化依赖于能量。微管聚合抑制剂
Noc
、
微囊泡内吞抑制剂
Ami
、
肌动蛋白聚合抑制剂
CyD
均
阻碍了
ad11-CV
的
细胞
摄取
，说明
CV
的内化涉及巨胞饮作用或吞噬作用。
ad11-CV
整个内化过程可分为五个阶段：细胞外、细胞表面、细胞膜包裹、内化和变形。如图
5
所示。
图
5.
TC-1
和
TC-1- hCD46
细胞对
ad11-CV
的摄取
接下来作者使用
携带
TC-1
细胞的
C57BL/6J
小鼠模型
评估了
ad11-CV
的体内抗肿瘤效果。发现
CV
可以增加
ad11
在肿瘤部位的保留，
ad11-CV
治疗显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠的生存时间。此外，
ad11-CV
处理的肿瘤组织中促炎细胞因子
IL-6
和
TNF
的水平显著升高，表明其增强了抗肿瘤免疫反应。
ad11-CV
处理的肿瘤中
CD8⁺ T
细胞数量增加，
M1
型巨噬细胞比例上升，而
M2
型巨噬细胞比例降低，进一步证实其对免疫微环境的调节作用。
如图
6
所示。
图
6.
ad11-CV
对肿瘤的体内免疫反应和溶瘤效果
综上所述，作者通过胆固醇修饰的单链
DNA
和组蛋白的液
-
液相分离成功构建了具有水性腔室和高密度外壳的囊泡状凝聚体，制备可以在水相中完成，简单方便。且这类囊泡状凝聚体可以负载多种生物药物并保持其活性，也可以促进细胞的摄取。但囊泡状凝聚体具体的组装规则、拓扑结构和分子分布机制仍需探索，未来有望用于递送更多治疗性药物。
作者：
YXM
DOI:
10.1038/s41557-024-01705-8
Link:
https://doi.org/
10.1038/s41557-024-01705-8
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