1. IOBR的主要分析流程
包含6大
模块
：
①数据预处理；②微环境解析和signature score计算；③微环境交互作用分析；④微环境与基因组的交互分析；⑤数据统计分析和可视化；⑥微环境模型构建；
该工具提供了丰富的微环境解析、微环境亚型鉴定、基因集评分计算方法、个性化的gene signature构建、scRNAseq的bulkseq验证、微环境相关基因变异、统计分析和可视化方法。
2. IOBR的函数解读
（1）数据准备
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基因表达数据的注释和转换
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count2tpm()
：将基因表达计数数据转换为每百万转录本（TPM）值。该函数支持“Ensembl”、“Entrez”或“Symbol”类型的基因ID，允许在线连接到bioMart数据库或本地数据集（由source参数指定）检索基因长度信息。
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anno_eset()
：使用提供的注释数据，为 ExpressionSet 对象 (eset)注释基因 symbol。它仅保留具有注释数据中具有匹配标识符的探针的行。该函数根据指定的方法处理重复项。输出是注释和清理后的表达集。
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remove_duplicate_genes()
：从基因表达数据中删除重复的基因 symbol。基于
基因 symbol的
平均值（如果方法设置为“mean”）或标准偏差值（如果方法设置为“sd”）来保留基因。
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mouse2human_eset()
：将表达集的小鼠基因转化为人类基因。该函数的目的是为了将小鼠的表达矩阵转化成以人的基因symbol为行名的表达矩阵，然后用于肿瘤微环境的解析。
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find_outlier_samples()
：分析基因表达数据并基于连通性分析（connectivity analysis）识别潜在的异常样本。通过利用“WGCNA”包，该函数计算每个样本的归一化邻接性和连通性 z 分数。它还提供多个参数来自定义分析和可视化。
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remove_batcheffect()
：从给定的表达数据集中移除批次效应，并使用主成分分析 (PCA) 可视化校正后的数据。它接受三个表达数据集作为输入，并使用“sva::ComBat”或“sva::ComBat_seq”方法进行批次效应校正。然后，该函数生成 PCA 图以比较校正前后的数据。
（2）TME反卷积模块
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集成多种算法来解码免疫微环境
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deconvo_tme()
：通过各种反卷积方法，基于bulk RNAseq、微阵列数据或单细胞 RNAseq 数据，解码TME浸润模式。目前支持的方法包括
“CIBERSORT”、 “MCPcounter”、 “EPIC”、 “xCell”、 “IPS”、 “estimate”、“quanTIseq”、“TIMER”、“SVR”和“lsei”。
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generateRef()
：生成新的基因参考数据，用于特定特征的反卷积，例如浸润细胞，利用不同的方法来识别差异表达基因（DEG）。该函数支持“limma”和“DESeq2”方法。生成的基因参考数据可用于带有“svr”和“lsei”算法的 deconvo_tme()。
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generateRef_seurat()
：采用 Seurat 对象“sce”和附加参数来执行生成参考基因表达数据的各种操作。它允许指定细胞类型、比例、测定、预处理选项和统计测试参数。生成的基因参考数据可用于
deconvo_tme()，与
“svr”和“lsei”算法一起使用。
（3）signature模块
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计算signature分数，估计表型相关特征和相应基因，并评估来自单细胞RNA测序数据生成的特征
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calculate_sig_score()
：计算内置于IOBR包的特征基因集分数，涉及TME相关、肿瘤代谢和肿瘤内在特征。支持的签名分数计算方法包括“PCA”、“ssGSEA”、“z-score” ”，以及“Integration”。
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feature_manipulation()
：对特征进行预处理，包括细胞分数和源于多组学数据的特征，用于后续分析和模型构建。预处理包括：删除缺失值、离群值、非数值和无显著方差的变量。
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format_signatures()
：通过输入一个特征名称作为相应基因集列名的数据框，为calculate_sig_score()函数
生成
对象，并返回一个包含多个特征基因集的特征列表，用于计算多个特征分数。
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format_msigdb()
：将gmt格式的特征基因集数据转换为calculate_sig_score()函数的对象，该数据不包含在IOBR的特征集合中，可以在MSgiDB网站上下载。
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sig_gsea()
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根据差异基因表达数据
进行基因集富集分析（GSEA），以识别重要的基因集。该函数使用 fgsea 包进行 GSEA，并以表格和图形的形式提供可视化和结果。它支持使用用户自定义的基因集或使用 MSigDB 中的预定义基因集。
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get_sig_sc()
：从单细胞差异分析中提取每个细胞类型排名靠前的基因，作为相应细胞类型的特征基因集，为
calculate_sig_score()函数生成对象
。输入是一个包含
假定marker的排名列表以及相关统计数据（p 值、ROC 分数等）的
矩阵。
（4）批量分析和可视化：
批量生存分析和相关性分析等其他批量统计分析
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batch_surv()
：执行批量生存分析。它根据包含时间相关信息的给定数据，计算指定变量的风险比和置信区间。
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subgroup_survival()
：从亚组分析的coxph对象中提取风险比和置信区间。
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batch_cor()
：使用皮尔逊相关系数或斯皮尔曼等级相关系数，对两个连续变量之间的相关性进行批量分析。
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batch_wilcoxon()
：对给定数据集执行 Wilcoxon 秩和检验，以比较两组之间指定特征的分布。它计算 p 值，并根据 p 值对显著特征进行排名。它返回一个数据框，其中包含特征名称、p 值、调整后的 p 值、p 值的对数，以及基于 p 值范围的星级评定。
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batch_pcc()
：提供一种批量处理方法，在控制第三个变量的情况下，计算特征与其他特征之间的偏相关系数。
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iobr_cor_plot()
：对“sig_group”特征的批量相关性分析结果的可视化。还支持可视化特征或表型与目标特征中基因集的表达之间的相关性。
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cell_bar_plot()
：TME细胞分数的批量可视化，支持输入“CIBERSORT”、“EPIC”和“quanTIseq”方法的反卷积结果，以进一步比较一个样本内或不同样本之间的TME细胞分布。
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iobr_pca()
：执行主成分分析（PCA），在保持大部分原始方差的同时降低数据的维数，并在散点图上可视化PCA结果。
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iobr_deg()
：使用DESeq2或limma方法对基因表达数据进行差异表达分析。它过滤低计数数据，计算倍数变化和调整后的 p 值，并根据指定的截止值识别 DEG。
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get_cor()
：计算并可视化数据集中两个变量之间的相关性。它提供了缩放数据、处理缺失值和合并额外数据的选项。该函数支持多种相关性分析方法。它能根据亚组类型/类别生成散点图并添加回归线，此外还提供了多种自定义可视化选项。
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get_cor_matrix()
：计算并可视化数据集中两组变量之间的相关矩阵。它能够灵活地定义相关方法、处理缺失值和合并附加数据。该函数支持各种相关性分析方法，例如“Pearson correlation”，并在可自定义的图中显示相关结果。
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roc_time()
：生成随时间变化的接收者操作特性（ROC）图，以评估生存分析中一个或多个变量的预测性能。它计算每个指定时间点和变量组合的曲线下面积 (AUC)，并创建一个带有相应 AUC 值注释的多线 ROC 图。
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sig_box()
：生成带有可选统计比较的箱线图。它接受各种参数（例如数据、特征、变量等）来自定义绘图。它可用于可视化和分析 Seurat 对象或任何其他数据框中的数据。
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sig_heatmap()
：根据输入数据、分组变量和可选条件生成热图。该功能允许自定义各种参数，例如调色板选择、缩放、颜色框、绘图尺寸等。它以简洁且信息丰富的方式灵活地可视化变量和组之间的关系。
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sig_forest()
：创建森林图，用于可视化“batch_surv”生成的生存分析结果，可通过参数设置需要展示的变量数量。
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sig_roc()
：在单个图中绘制多个 ROC 曲线，便于比较不同变量预测二元响应方面的能力。
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sig_surv_plo
t()：为给定的基因、基因评分和细胞浸润评分生成多个 Kaplan-Meier (KM) 生存图。它允许进行详细的定制，并且结构化以处理生存分析的各个方面。
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find_markers_in_bulk()
：从给定的基因表达数据和元信息中查找相关结果。它利用“Seurat”包中的FindAllMarkers()函数来识别给定数据中多个组的显著变量。支持的比较方法包含 “bootstrap”、“delong”和“venkatraman”。
（5）signature相关突变模块
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识别和分析与目标特征相关的突变
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make_mut_matrix()
：以合适的方式将MAF格式的突变数据（包含基因ID列和相应的基因改变，包括SNP、indel和移码）转换为突变矩阵，以进一步研究与特征相关的突变。
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find_mutations()
：识别与不同表型或特征相关的突变。该函数进行 Cuzick 检验、Wilcoxon 检验，或两者同时进行（当方法设置为“multi”时）。它为通过这些统计检验识别的最显著的基因生成箱线图，并创建 oncoprints ，以图形方式展示样本间的突变景观。
