培养肉（人造肉）能在未来取代传统肉类吗？

不断增长的世界人口、公众对动物的关注、环境影响以及肉类消费的变化，促使人类不断寻求食品生产的新方法。新型食品包括具有新的或特殊修改的分子结构的产品，由微生物、真菌、藻类或昆虫制成的食品，动物细胞或组织培养而成的食品。后一种食品通常被称为：“清洁肉”、“离体培养肉”和“(细胞)培养肉”。这种方法是从家禽中分离细胞并在体外扩增，以产生用于非结构化肉类的细胞生物量，或者在支架上培养和分化细胞，以产生结构化肉类类似物。尽管这是一个快速增长的领域并吸引了投资者和政府的高度关注，但培养肉生产仍面临一系列挑战，包括细胞来源选择、可负担的扩张、无残忍和食品级培养基的使用、监管问题和消费者接受度。

图1：“离体厨房”艺术项目图，其中包括与餐厅相连的细胞培养室，以及一个可以分离出青蛙肌肉细胞的玻璃容器。

肉类主要由肌肉细胞组成，其次是结缔组织细胞（如成纤维细胞）、脂肪细胞（脂肪细胞）、血管和细胞外基质（ECM）（表1）。肉类含有75%的水、19%的蛋白质、2.5%的脂肪、1.2%的碳水化合物和1.65%的氮化合物。除了营养和安全方面，肉类的质量和可接受性在很大程度上取决于其感官特性：外观、香气、口感和质地。影响肉类主要风味分子包括氨基酸、血红蛋白、硫化物和羰基化合物、短肽和脂类。

制造培养肉的几种方法：

到目前为止，已经开发出了几种方法来制造替代肉类。一是以蛋白质为基础的方法用于生产肉类替代品，其中包括植物蛋白和昆虫蛋白。这种方法采用挤出工艺，将蛋白质同时混合、揉捏，并在压力下迅速加热，以产生具有类似肉质的挤出物。蛋白质基肉类的生产包括三个步骤：（1）蛋白质提取和修改，（2）添加食品级粘合剂、植物脂肪和面粉进行配方，（3）通过蛋白质重塑过程创建类似肉质的质地。二是以细胞为基础实现细胞生物量扩增及最终的无支架配方来替代肉类。从动物组织中分离出干细胞或分化细胞，然后在细胞培养瓶或生物反应器中培养，以达到所需的生物量。纤维基方法是由Maastricht的Post工作组开发的。这种方法中，数百个肌肉细胞自组织成纤维，形成肌肉/肉类的结构。基于组织的方法代表了体外培养肉类生产中最复杂的技术。在这种技术中，不同类型的细胞在可食用支架上进行培养，以产生类似肉的结构。

组织工程在培养肉生产中的应用

在动物体外培养细胞的概念并不是最近首次提出，细胞培养技术已有100多年的历史。为了创建有结构的培养肉，许多研究人员使用了组织工程的最新原理，而这些原理最初是为再生医学而开发的。然而，医学领域的培养组织是在非常严格的生产规范（GMP）下进行开发和优化的，涉及生物功能、降解性和植入后细胞存活等多方面指标。但现代培养肉关注的是依据能否用经济实惠和可持续的方式生产具备感官和营养特性的肉质产品为标准。组织工程方法涉及组织制造的四个主要步骤：（1）活检，（2）细胞分离，（3）细胞扩增，和（4）细胞在支架上分化，培养肉的生产也用同样的方法（图2）。

图2：培养肉生产流程图

培养肉生产的三个挑战

在培养肉生产中，有五个主要的优化领域：（1）细胞选择和优化，（2）培养基组成，（3）扩张策略，（4）分化协议，以及（5）使用的支架材料（图3）。

图3：培养肉生产中的优化领域和相关参数

细胞选择和优化

培养肉生产中的细胞选择受到多个因素的影响。首先，公司通常声称通过无痛活检从活体动物中分离细胞。然而，为了获得良好的起始细胞群体，需要比典型活检样本更大的组织样本。为了获得更多的细胞数量，有三种主要策略：直接分离大量细胞、细胞不老化和选择快速生长的细胞。第一种策略是从宰杀动物的组织中分离高数量的分化细胞，但这并没有解决现有的挑战；第二种策略是创建不老化的、无限可再生的细胞库。然而，初级分离的成体干细胞并不是不老化的；它们在体外只能进行有限次数的细胞倍增。因此，选择快速生长的细胞似乎是目前一个有前景的方法。与分化细胞相比，干细胞具有较高的增殖率，并且可以长时间培养。研究中常用的几种干细胞类型包括：胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）和间充质干细胞（MSCs）或卫星肌细胞（SMCs）。

培养基组成

几乎所有哺乳动物细胞扩增的方案都使用细胞培养基，培养基由基础培养基和血清补充物组成。基础培养基提供葡萄糖、氨基酸、生理pH值和渗透压，而血清补充物则提供生物信号分子、生长因子、激素和粘附因子。由于标准血清补充物都是动物来源的，其中最常用的是来自未出生胎儿血液的胎牛血清（FCS）。有几种降低生产成本的策略。例如，（1）回收已用培养基，去除有毒代谢产物（乳酸、氨）——研究表明，细胞培养基废液中仍然有50%的氨基酸存在；（2）实时分析培养基组成，监测细胞对培养基成分的使用情况，并迅速替换用尽的成分，而无需完全更换培养基；（3）使用食品级而不是药品级的培养基成分；（4）用植物蛋白水解物替代通过发酵单独生产的氨基酸；或者（5）寻找能够支持细胞生长和分化的新的生物活性植物分子，或者使用具有抗菌作用的天然生物活性化合物代替抗生素和抗真菌药物。

扩增策略

大多数哺乳动物细胞属于依赖附着的细胞类型，需要生长表面或依赖细胞间相互作用来进行体外增殖。附着依赖性导致表面积受限，不易扩大生产规模。一般有三种方法将依赖附着的细胞转变为悬浮培养：（1）在微载体上培养，（2）细胞聚集体，以及（3）将细胞封装在水凝胶中。为了避免使用蛋白酶进行收获（用于从微载体表面恢复细胞），可以在可食用的微珠（如大豆、玉米蛋白）上培养细胞。在这种情况下，珠子的材料选择必须经过仔细考虑，因为它们可能会影响最终肉制品的感官特性，如口感、颜色和质地。从肌肉细胞中提取1公斤蛋白质需要2.9×10¹¹至8×10¹²个细胞，即需要一个容量高达5000升的搅拌式生物反应器（STR）。搅拌式反应器是最常用的反应器类型之一，因为其结构相对简单，可扩展性强，且性能得到了充分的验证。然而，对带有微载体的搅拌式反应器进行的计算流体力学（CFD）模拟显示，存在氧气和剪切应力梯度，而通过通气引入了更多的流体力学应力。气升式生物反应器也被作为哺乳动物细胞培养的候选平台。还有其他几种适用于哺乳动物细胞扩增的机械驱动反应器类型，如垂直轮式生物反应器和波动反应器。另外，还可以使用液压驱动的生物反应器（例如中空纤维生物反应器和固定床生物反应器）。在此类系统中，细胞收获也可能成为问题，因为解离试剂不能有效地渗透到3D生长的细胞团中。

补料策略也是一个复杂的问题，需要实现高效益的生产而又不影响细胞增殖和存活。在实验室中常规的2D细胞培养中，培养基每3到4天完全更换一次，以保持高细胞存活率。然而，在这段时间内，氨基酸和葡萄糖并没有完全消耗。因此，可以采取部分更换培养基的方法以减少运营成本。生长中的哺乳动物细胞培养液中毒代谢物的积累是一个严重的限制，例如浓度为2-10 mM的氨对细胞具有抑制作用。乳酸的积累也可以通过降低pH间接影响细胞增殖，并且在一定浓度下直接对细胞具有毒性。在批次和滴注分批过程中，毒性浓度比灌流系统更快达到，但灌流系统需要更大的培养基体积。

支架材料

培养肉生产的支架材料也正在进行深入的研究。在扩增过程中，可食用材料既可以作为微载体使用，也可以作为纹理肉的支架，用于创建有吸引力的肉类模拟品。支架材料的应用不仅取决于它们的成分，还取决于最终的性能，如多孔性、可降解性、可调性和刚度。材料的多孔性将允许细胞渗透到支架中，并在培养过程中提供营养。可调性和刚度将直接影响细胞的生长和分化，以及最终产品的特性。多种材料可以用作微载体或支架：多糖-藻酸盐、淀粉、壳聚糖、果胶（虽然它们不含细胞黏附的特殊基序）；多肽和蛋白质-胶原蛋白、弹性蛋白、明胶（但不是来自动物的明胶）、麦麸蛋白、脂质-石蜡、虫胶（可能带来油腻的风味）、合成材料-聚谷氨酸、聚乙二醇及复杂的天然成分，如菌丝体和细胞脱细胞植物组织，也是非常有吸引力的候选材料。

还有研究报道了由明胶、藻酸盐、魔芋、大豆、麦麸蛋白、玉米蛋白和壳聚糖制成的可食用图案薄膜（用于将肌肉细胞定向排列成肌管）。这里方式的主要问题不是材料本身而是支架的尺寸/厚度，这可能会影响细胞在缺氧和营养输送系统（血管化）不存在的情况下的存活能力。

分化

为了产生肌肉或脂肪细胞，干细胞必须经历分化和成熟过程。为再生医学制定的标准分化方案包括使用不同类型的分化因子，包括激素和小分子（有时具有毒性）。尽管这些列出的物质已获得用于治疗不同疾病和病症的批准，但它们并未获得人类食用的批准。在肌原性分化的背景下，也会使用氢化可的松和地塞米松等物质作为分化培养基中的成分。为了解决这个问题，研究人员正在探索天然植物物质诱导分化的潜力。如正在测试中的中药材：丹酚酸B、淫羊藿苷和黄芪苷。

支架材料的化学和物理性质在干细胞分化中也起着重要作用。大多数干细胞对机械环境信号具有敏感性，这意味着这些细胞可以识别机械环境信号并将其转化为细胞内生物信号。有选择地设计支架材料的性质是一种巧妙的方法，可以帮助补充或潜在地甚至消除外源性分化因子的使用。可以证明，材料的组成可以影响软骨生成和骨生成的分化。葡萄糖和氧气浓度等化学因素也是细胞分化的重要调节因子。

另一个问题是对种植在支架上的不同类型细胞的同时分化。例如要在一个细胞类型中触发脂肪分化而不影响另一个细胞类型中的肌肉分化。因此，开发出分化因子混合物是有难度的。

监管挑战和认可

监管的重点问题是术语问题：美国和欧洲的农民正在寄希望于一项新法律，只允许将来源于动物的产品称为“肉类”。如果培养肉不被认为是肉类，那么它应该像传统肉类一样受到监管吗？欧盟对培养肉的监管框架早在1997年就已确立，并在2018年进行了更新。如果细胞或生物体没有经过基因改造，该产品将受到欧盟新食品法规的规范。经过基因改造的细胞（例如iPSCs）受到欧盟转基因生物法规的约束。监管的一般原则是产品安全、健康和无杂质。在欧盟新食品法规的授权下，应提供有关产品的身份、制造过程、成分、拟议使用、使用量和预期摄入量的信息。额外的信息应包括过敏原性、营养和毒理特性，以及吸收、分布、代谢和排泄。欧洲食品安全局向欧洲委员会提供意见，并将该食品与欧盟市场上存在的类似类别进行比较。

下一个重要点是消费者对培养肉的接受度。到目前为止，只有新加坡提供了培养肉的市场，因此很难分析和评估关于体外培养肉产品的需求和消费者行为。Bryant和Barnett进行了一项关于消费者接受度的分析，结果显示消费者的接受比例在不同国家的受访者组之间有很大的差异，从5％到65％不等。这表明尤其是年轻、受教育程度较高和自由主义的消费者对培养肉感兴趣。其他研究表明，城市群体比农村群体更快接受培养肉，男性比女性更有可能尝试。对消费者行为的全面调查统计发现，大多数消费者目前愿意尝试培养肉，但不一定会每天将其替代传统肉类。

原文链接：M.Kirsch, J.Morales-Dalmau, A.Lavrentieva, Cultivated meat manufacturing: Technology, trends, and challenges. Engineering in Life Sciences, 2023.

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入

生物制品微信群！