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Nat. Catal.封面：开拓金属酶催化新疆域—光/金属酶协同催化构建手性C‒N₃、C‒SCN键

X-MOL资讯 · 公众号 · · 2024-12-28 08:09

正文

合成化学经过两个多世纪的不断发展，已建立起坚实而深厚的理论与实践基础，成为现代科学与工业的重要支柱。相比之下，合成生物学作为一门新兴学科，其发展历史尚不足50年，底层研究积累相对薄弱，仍处于快速探索与成长阶段。这一对比在反应种类的数量上尤为显著：目前已知的化学反应超过1亿种，而生化反应的数量尚不足10万种。如此巨大的差距不仅揭示了合成生物学在基础研究上的相对局限，也凸显了生物催化在未来开发与应用中的广阔潜力。随着对生物催化机制的深入理解以及新工具和技术的不断涌现，生物催化反应的发展有望实现从“量”到“质”的飞跃，推动这一领域迈向新高度，为解决全球性挑战提供更加高效、绿色的化学转化手段。

图1

约翰霍普金斯大学黄雄怡 （Xiongyi Huang）课题组长期致力于探索合成化学与合成生物学的有机结合，开辟跨领域协同创新的新路径（图1）。该课题组的前期研究聚焦于将非天然化学反应融入金属酶催化体系，通过酶的定向进化手段重新塑造金属酶的催化机制，显著拓展了金属酶的催化功能与应用领域。其代表的开创性工作包括：定向进化非血红素铁酶实现非生物的自由基接力C( s p ³ )-H叠氮化（ Science , 2022 , 376 , 869-874, 点击阅读详细）；工程化非血红素铁酶通过自由基氟转移对映选择性构建C( s p ³ )-F键（ Nat. Synth ., 2024 , 3 , 958-966, 点击阅读详细）。近期，黄雄怡课题组进一步突破传统框架，成功设计了一种 结合光催化与金属酶催化的新型光/金属酶协同催化体系。 这一体系通过 引入光驱动的自由基生成过程，将天然非血红素铁酶改造成一种光驱动的自由基转移酶，能够实现对映选择性的自由基转化反应 （图2）。这一创新策略不仅为开发复杂的生物光催化反应提供了重要的实现途径，也为金属酶的功能拓展和应用创新开辟了全新方向，展现了其在合成化学与生物催化融合中的巨大潜力。

图2

过去十年间，光酶催化领域取得了显著进展，成为生物催化研究中的一大热点。然而，这些研究主要集中于依赖有机辅因子的酶，例如含黄素辅因子、磷酸吡哆醛辅因子、烟酰胺辅因子或硫胺素辅因子的酶。相比之下，基于金属酶的光催化反应在生物催化中的发展明显滞后，这一现状与金属光氧化还原催化在合成化学中的蓬勃发展形成了鲜明对比。在典型的光/金属协同催化循环中，光催化剂在光照下驱动底物生成活性自由基物种，这些自由基随后与金属中心作用，实现多样化的化学转化。这一催化策略的显著优势在于光催化剂和金属复合物的特性可以独立优化，从而赋予反应高度的可调控性。尽管这一策略已在合成化学中展现出非凡的潜力和广泛的应用，其在生物催化领域的探索却依然处于初级阶段，鲜有突破性进展。这种缺失不仅限制了光催化和金属酶协同催化在生物系统中的开发，还阻碍了其在更广泛的化学生物学和工业应用中的潜力释放。在这一背景下，黄雄怡课题组将光/金属协同催化与生物催化相结合，为拓展金属酶催化反应的边界提供了新的可能性。通过整合“光驱动自由基生成”与“金属酶调控的对映选择性自由基捕获”两大优势，开发出一种全新的光/金属酶协同催化体系。这种体系不仅能够实现更复杂的化学反应，还能显著扩展生物催化自由基反应的应用范围，并为解决复杂化学与生物学问题开辟新的思路。

该课题组的最新研究展示了一种结合光催化与金属酶催化的创新策略。 在绿光照射下，光催化剂 Eosin Y 能有效诱导 4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）催化氧化还原活性酯的对映选择性脱羧叠氮化和硫氰酸化反应。 研究的第一步是通过分子对接分析，评估一系列非血红素铁酶活性位点对底物 1-NHPI 的容纳能力。分子对接结果显示，有六种酶表现出较好的底物结合效果，被选为候选酶进行进一步实验。为了验证这些候选酶的催化潜力，研究者选用氧化还原活性酯 1-NHPI 作为模型底物，叠氮化钠作为叠氮源，并测试了多种光敏剂对反应的影响。筛选结果表明，在光敏剂 Eosin Y 或荧光素的作用下，非血红素铁酶 HMS、HPPD 和 IPNS 均展现出一定程度的反应活性和立体选择性（图3a）。其中，HPPD 与 Eosin Y 在绿光照射下表现出最优的催化效果，生成目标叠氮化产物的收率达到 21%，总转化数（TTN）为 140，对映选择性比率（er）为 70:30。为了明确反应的关键因素，研究者设计了多项对照实验。在无光照或无光催化剂的条件下，未检测到任何叠氮化产物；在无酶催化剂的条件下，仅观察到少量的外消旋产物，推测可能是溶液中铁催化的背景反应所致。此外，研究者将 HPPD 的两个关键铁配位组氨酸突变为丙氨酸后，生成的叠氮化产物量显著减少。这些实验结果强烈表明，反应主要发生在酶的活性位点，并由非血红素铁中心主导催化过程。

图3

基于初步的实验结果，研究者对催化体系进行了深入的优化工作，进一步提升酶的催化效率和对映选择性。为了改进催化性能，作者选择了靠近底物结合区域和活性位点的七个关键氨基酸残基，对这些位点进行了定点饱和突变（SSM）（图3b）。通过突变筛选，研究者发现 HPPD V189A 突变体显著提升了酶的催化活性，总转化数（TTN）从初始值提高到 240，同时手选择性优化至 er = 73:27。这一突变改善了酶的活性位点结构，使其能够更高效地与底物自由基发生作用。在以 HPPD V189A 为母体的进一步筛选中，研究者发现 S230Y 突变对产物的对映选择性具有显著提升作用，ee值达到初始的两倍。通过分子模拟分析，研究者推测 S230Y 突变在活性位点附近创造了一个更加疏水的微环境。这一疏水环境可能通过疏水相互作用或 π-π 堆积效应，将底物自由基引导至更接近 Fe(III)‒N₃ 中间体的位置，从而显著促进了 C‒N₃ 键的高效形成。基于 HPPD V189A/S230Y 双突变体，研究者进一步通过 SSM 筛选，最终成功构建了一个四重突变体 HPPD C188A/V189A/S230Y/Q255A（简称 Sav HPPD-PC）。这一优化的突变体展现出卓越的催化性能，能够以 TTN = 200 和 er = 94:6 的高选择性生成目标叠氮化产物（图3c）。在优化过程中，研究者还观察到一种主要副产物——异氰酸酯，推测其生成机制可能与非酶催化的 Curtius 重排有关。值得注意的是，尽管异氰酸酯的生成是竞争性副反应，但随着酶催化效率的提升，叠氮化产物与异氰酸酯的选择性（N₃/NCO）显著改善。这一改进表明，优化后的酶能够更有效地推动叠氮化反应，抑制副反应的发生。

图4

在优化了反应条件并筛选出最优突变体后，作者对该光生物催化体系的底物耐受性进行了系统而深入的研究（图4）。研究结果表明，苯环上带有卤素、甲基和甲氧基取代基的底物表现出良好的耐受性，能够顺利参与反应并生成目标产物。然而，带有较大空间需求的异丙基或三氟甲基取代基的底物未能反应。这一现象被归因于活性位点的立体位阻效应。酶的活性位点由残基 P243、S230、F364、L367 和 F336 共同形成的疏水性口袋决定，其设计能够容纳苯基底物，但苯环取代基的邻位、对位或间位与这些残基的距离较小（小于 4 Å）。这种空间限制对苯基取代基的尺寸耐受性造成了明显影响。此外，三氟甲基的电子效应可能进一步阻碍了反应的进行。这些发现表明，底物的电子特性与空间结构均是影响反应效率的重要因素。在对芳香族底物进行考察后，作者进一步评估了一级、二级和三级烷基酸的 NHPI 底物的表现。这些底物在反应中的转化效率显著降低，其主要限制因素包括羧基自由基脱羧速率较慢以及生成的 C( s p ³ ) 自由基稳定性较差。其反应的 TTN 范围仅为 27 ~ 124，远低于苄基类底物。为了探索该体系的多样性，研究者还考察了其他类型的反应试剂，包括胺、醇、卤素和拟卤素。然而，大多数测试试剂未能发生反应。这可能是由于这些试剂无法与 HPPD 的铁中心有效结合，从而未能启动关键的催化步骤。值得注意的是，当叠氮化物被替换为硫氰酸盐时，作者观察到了显著的酶催化活性。该体系成功生成脱羧硫氰化产物，TTN 范围为 45~114，对映选择性（er）介于 56:44 至 78:22 之间。尽管对映选择性尚未达到较高水平，但这是首次报道生物催化自由基 C( s p ³ )‒SCN 键的形成，突显了这一光生物催化策略在开发新型金属酶自由基反应中的潜力。

图5

随后， 黄雄怡 课题组与卡内基梅隆大学 郭以嵩 课题组以及西班牙赫罗纳大学 Marc Garcia-Borràs 课题组合作，通过多种实验和分子动力学模拟手段对该反应的机理进行了深入探索。首先，作者监测了反应过程中外消旋底物 1-NHPI 的对映体比例变化（图5a）。结果显示，尽管产物逐渐生成，底物始终以消旋体形式存在。这表明酶能够高效地结合 ( R )- 和 ( S )- 1-NHPI 对映体，并将其均等转化为自由基中间体。为了验证关键反应中间体 Fe(III) 的形成，作者利用电子顺磁共振（EPR）研究分析了体系的行为（图5b）。在无 1-NHPI 存在的条件下，光照仅导致极少量 Fe(III) 的生成。然而，加入 1-NHPI 后，Fe(III) 中间体的积累显著增加。作者推测，这一现象可能源于两种机制：（1）初步的单电子转移（SET）发生在 1-NHPI 与光激发态的 Eosin Y 之间；（2）Fe(II) 首先与光激发态的 Eosin Y 发生 SET，但由于没有 1-NHPI 存在，随后发生的反向电子转移迅速淬灭了还原态的 Eosin Y，从而限制了 Fe(III) 的积累。为了区分上述两种可能性，作者进一步进行了斯特恩-沃尔默猝灭实验（图5c）。结果显示，无论是否存在酶催化剂， 1-NHPI 均无法猝灭 Eosin Y 的荧光信号。尽管 Fe(II) 单独也未能显著猝灭 Eosin Y，但在酶的存在下，其猝灭效率提高了四倍以上。这一结果表明，酶的存在在光催化剂与铁中心的电子转移过程中起到了至关重要的桥梁作用，可能通过优化铁中心与 Eosin Y 的空间距离来促进 SET 的发生。

分子动力学模拟和分子对接分析进一步揭示了 Eosin Y 在 Sav HPPD-PC 上的结合模式（图5d）。结果表明，Eosin Y 的潜在结合位点富含赖氨酸和精氨酸残基，这与 Eosin Y 通过极性表面残基结合蛋白质的已知特性一致。此外，所有结合位点均位于距离铁中心 20 Å 以内，支持铁与 Eosin Y 之间直接长程电子转移的可能性。这些结合位点的分布为催化剂与金属中心间高效协作提供了结构基础。综合实验与模拟结果，作者提出了两种可能的催化循环（图6）。尽管无法完全排除催化循环 1的可能性，实验数据更支持催化循环 2 的模型。在这一循环中，光激发态的 Eosin Y 首先将 Fe(II) 氧化为 Fe(III)，随后还原态的 Eosin Y 通过第二次 SET 激活 NHPI 底物，产生底物自由基并通过金属中心的自由基捕获完成催化过程。

图6

小结

Nat. Catal.封面：开拓金属酶催化新疆域—光/金属酶协同催化构建手性C‒N₃、C‒SCN键

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