新冠病毒 RNA 病毒的特征导致了高突变率，从而产生了药物耐药性问题。针对关键病毒蛋白（如主蛋白酶M
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）的抑制剂开发是控制病毒复制的有效策略。然而，随着临床广泛使用Nirmatrelvir，对耐药性的担忧日益增加。虽然临床上尚未报道对Nirmatrelvir产生耐药性的M
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变体，但体外研究表明，病毒在选择压力下可获得耐药性突变。研究者发现，M
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的底物结合口袋中的S1和S4位点突变会破坏Nirmatrelvir的结合能力。此外，S2和S4'位点突变导致主蛋白酶活性增加。常见的突变包括L50F和E166V，而且M
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能同时沿着两个途径进化，产生L50F+E166V双突变。
为了应对耐药性问题，研究者提出了一个新颖的药物筛选策略。他们首先使用分子动力学（MD）模拟来探索耐药机制。随后，研究者进行了高通量虚拟筛选 (HTVS), 综合运用基于配体的相似性搜索、多构象对接和MD模拟。结果显示，NMI-003 (Z1557501297) 与 Nirmatrelvir 相比，对M
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E166V和M
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_L50F+E166V具有更强的抑制活性，其EC
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分别为8.76±0.96μM和13.67±1.33μM。这些发现突出了开发针对耐药突变体的新型抑制剂的重要性。研究者认为，这种方法对于快速识别针对新冠病毒M
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耐药突变的有效抑制剂至关重要。
相关研究于2024年10月10日，以Molecular Mechanism-Driven Discovery of Novel Small Molecule Inhibitors against Drug-Resistant SARS-CoV-2 M
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Variants为题发表在Journal of Chemical Information and Modeling上。
针对SARS-CoV-2 M
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抑制剂的计算与实验方法
作者通过分子动力学模拟、虚拟筛选和体外实验相结合，系统性地研究了SARS-CoV-2 M
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抑制剂的活性。
分子动力学模拟 (Molecular Dynamics Simulations)：
首先使用PyMOL对SARS-CoV-2 M
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的野生型和L50F、E166V、L50F+E166V突变体与NMI-001和NMI-002复合物进行了建模。随后，使用Antechamber工具包和AMBER ff14SB力场分别准备了小分子化合物和蛋白质的力场参数。利用LEaP模块生成模拟系统的拓扑和坐标文件，并加入反离子和水分子，构建了符合要求的周期性边界模拟系统。
模拟设置 (Simulation Settings)：
所有分子动力学模拟均在AMBER18软件中，通过GPU加速进行。能量最小化分两步进行：首先使用约束势，然后释放所有原子进行自由移动。随后进行两阶段升温，最终进行平衡模拟。所有体系在NPT系综下，于310K温度和1atm压力下进行了100 ns的生产模拟。通过自动脚本，获得了总时长为 54.2 μs的分子动力学模拟轨迹，涵盖了NMI-001、NMI-002以及536个新化合物与三种突变体M
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的复合物。
模拟分析 (Analysis of MD Simulations)：
CPPTRAJ用于分析轨迹的结构性质，例如稳定性。计算了每个复制相对于初始结构的均方根偏差（RMSD）来监测模拟的收敛性，并通过M
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的Cα均方根波动（RMSF）研究了突变导致的构象变化。此外，还提取了平衡轨迹中的代表性结构，用于展示抑制剂和M
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之间的结合模式。通过MM/GBSA方法计算了结合能，并通过能量分解分析确定了关键残基。公式 (1)：
高通量虚拟筛选 (High-Throughput Virtual Screening)：
研究者结合基于配体的相似性搜索和基于结构的对接方法，对来自多个供应商的六个化合物库进行了高通量虚拟筛选。
基于整体分子相似性的骨架跳跃 (Scaffold Hopping by Holistic Molecular Similarity Search)：
使用WHALES描述符对NMI-001（模板）进行骨架跳跃，检索出与模板相似的化合物。选择WHALES描述符来编码几何原子间距、分子形状和原子性质。最终保留968个化合物进入后续步骤。
基于结构的虚拟筛选 (Structure-Based Virtual Screening)：
考虑靶蛋白口袋的灵活性，利用来自MD模拟的八种SARS-CoV-2 M
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构象系综进行对接。采用三阶段对接流程，包括高通量虚拟筛选、标准精度对接和额外精度对接。对接前使用Protein Preparation Wizard和LigPrep模块准备了化合物结构和复合物结构。选择对接分数低于-4.60 kcal/mol的分子，并使用分子动力学模拟验证了其结合模式和结合亲和力。
体外实验 (In Vitro Experiments)：
SARS-CoV-2抑制试验 (SARS-CoV-2 Inhibition Assay)：使用Vero E6细胞，以不同浓度化合物处理细胞后，感染野生型或表达mNeonGreen报告蛋白的耐药SARS-CoV-2突变体（L50F、E166V、L50F+E166V）。24小时后，测定细胞裂解物的荧光值，并计算EC
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值。
IC
50
测定 (IC
50
Measurement)：
在大肠杆菌中表达并纯化His标签的SARS-CoV-2 M
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野生型和三个突变体。使用底物Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans测定M
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的活性。在与不同浓度化合物共培养后，测量荧光强度，计算IC
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值。
作者研究了两种化合物NMI-001和NMI-002与野生型及突变型SARS-CoV-2 M
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的结合稳定性。通过分子动力学模拟，发现L50F、E166V以及L50F+E166V突变对NMI-001和NMI-002的结合影响较小。如图2所示，这些突变体与抑制剂的结合模式与野生型相似，氢键和疏水相互作用是主要的结合方式。
图1 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 M
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野生型（WT）和三个突变体（L50F、E166V和L50F+E166V）中（A）NMI-001和（B）NMI-002结合模式的结构比对。带有耐火砖和灰色的虚线分别代表氢键和疏水相互作用。
M
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的RMSD值显示突变体与抑制剂的复合物在模拟过程中保持稳定，且活性位点残基的RMSD值较低，说明突变对配体结合影响不大。RMSF分析表明，突变并未引起蛋白质构象的显著变化。
图2 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型M
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的野生型（WT）和三个突变体（L50F、E166V和L50F+E166V）中关键残基的能量分布有助于（A）NMI-001和（B）NMI-002结合。绝对能量贡献高于0.5千卡/摩尔的残留物被定义为关键残留物。这些关键残基对结合能量有重大贡献，有助于稳定Mpro活性位点的抑制剂。颜色越深，结合能贡献的绝对值就越大。
进一步的结合能分析（如图3所示）显示，E166V突变体中残基166的能量贡献增加，这表明该位点在突变体与抑制剂结合中起重要作用。
为了筛选出能克服耐药性的新型抑制剂，作者使用了基于NMI-001的骨架跳跃相似性搜索和基于结构的虚拟筛选相结合的方法。研究者从1500多万个小分子中筛选出了968个结构与NMI-001相似的分子，并进行了分层聚类分析。基于多个M
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构象（从分子动力学模拟中提取）的虚拟筛选过程，通过计算对接评分和MM/GBSA结合能（如图4所示）筛选出了潜在的候选化合物。
图3（A）nirmatrevir和（B-F）五种候选化合物对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型M
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WT的抑制作用以及Vero E6细胞中预测的相应突变体；通过检测发光来计算最大效应中值（EC
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）值的浓度。
通过MD模拟评估，并根据结合稳定性，结合模式和结合能等指标，最终选择了六种化合物进行分析。其中，Z1557501297（NMI-003）被选中进入实验验证。实验结果表明，NMI-003在体外对SARS-CoV-2的E166V突变体和L50F +E166V突变体具有较好的抑制活性（如图5，6所示），且优于nirmatrelvir。
图4（A）nirmatrevir和（B-F）五种化合物对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型M
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WT的抑制活性特征以及预测的相应突变体。通过基于荧光共振能量转移（FRET）的切割试验确定中值抑制浓度（IC
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）值。
作者进一步深入研究了NMI-003的抗耐药机制，通过分子动力学模拟分析了NMI-003与M
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E166V和L50F+E166V突变体的复合物，（如下图 7 所示）发现NMI-003能与突变体的结合口袋很好地匹配，其结合能分别为-49.04和-43.17 kcal/mol，疏水相互作用和氢键是主要的驱动力。
图5 新型化合物NMI-003抗药性特征的分子机制。NMI-003与M
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（A）E166V和（B）L50F+E166V的相互作用模式。M
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（C）E166V和（D）L50F+E166V与NMI-003结合的配合物中关键残基的能量贡献。
对复合物的结合能详细分析表明，V166突变残基在结合中起关键作用。NMI-003与突变体M
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结合时的关键残基在活性位点均匀分布，与S1-S4口袋良好匹配。同时，NMI-003与V166和Q189之间的相互作用进一步稳定了抑制剂与蛋白的结合。
针对新冠病毒M
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蛋白的Nirmatrelvir药物在体外选择性压力下，促使M
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蛋白产生了多种耐药突变。其中，L50F和E166V突变及其组合L50F+E166V突变，对新冠病毒有效治疗构成显著障碍。前期研究者已发现NMI-001和NMI-002这两种新型非肽抑制剂，它们具有独特的骨架和结合模式，区别于Nirmatrelvir。基于此，作者提出了一种药物设计策略，旨在快速筛选能够对抗突变诱导的耐药性的抑制剂。首先，利用分子动力学（MD）模拟，研究了NMI-001和NMI-002与三种耐药突变体（M
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L50F、M
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E166V和M
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L50F+E166V）的结合机制。
随后，作者进行了两阶段的高通量虚拟筛选。第一阶段，以NMI-001为模板，在一个包含15,742,661个化合物的库中进行了基于骨架跳跃的相似性搜索。第二阶段，通过分子对接和MD模拟，对968个与NMI-001相似的化合物进行了评估。鉴定出六个可能对至少一种突变体有效的化合物，并采购了五个化合物进行体外实验。最终，发现化合物Z1557501297（NMI-003）对E166V（IC
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=27.81±2.65μM）和 L50F+E166V（IC
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=8.78±0.74μM）突变体表现出抑制作用。研究者进一步在原子水平上阐明了NMI-003 与M
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E166V和NMI-003与M
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L50F+E166V的结合模式。NMI-003是首个对E166V和L50F+E166V突变体均有活性的化合物，为设计治疗耐药新冠病毒的新型抗病毒药物提供了良好的起点。
A：本文研究的主要目标是寻找能够有效对抗SARS-CoV-2 M
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蛋白药物耐药突变的新型小分子抑制剂。具体而言，研究针对尼马瑞韦 (Nirmatrelvir) 选择压力下产生的L50F, E166V以及L50F+E166V这些具有代表性的耐药突变，旨在快速发现能够克服这些突变导致的药物耐药性的抑制剂。
-
分子动力学 (MD) 模拟：
用于研究NMI-001和NMI-002与野生型及突变型M
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的结合机制。
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高通量虚拟筛选：
包括基于骨架跃迁的相似性搜索和基于结构的分子对接，用于筛选潜在的抑制剂。
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体外实验：
通过细胞感染实验和酶活性检测来评估化合物的抑制效果。
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MM/GBSA（分子力学-广义玻恩表面积）方法:
用于计算抑制剂与M
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的结合能，并通过残基能量分解分析识别关键残基。
Q3：为什么选择NMI-001作为模板进行相似性搜索？
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NMI-001是一种新型非肽抑制剂，它具有与尼马瑞韦不同的独特骨架和结合模式。
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NMI-001在与M
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结合时，与166位残基的相互作用较强。
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本研究发现的E166V突变对尼马瑞韦产生最严重的耐药性，因此NMI-001被认为是开发针对该突变抑制剂的合适模板。
A：分子动力学模拟中的系统制备和设置包括以下步骤：
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结构准备：基于NMI-001和NMI-002与野生型M
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的复合物结构，通过计算机模拟诱变生成L50F, E166V和L50F+E166V突变体的复合物。
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力场参数：使用Antechamber套件和AM1-BCC电荷模型计算小分子化合物的电荷，并使用parmchk2程序获得缺失的参数。蛋白质使用AMBER ff14SB力场描述。
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系统构建：使用LEaP模块生成模拟系统的promtop和inpcrd文件，包括分配力场参数，加入抗衡离子，并将结构浸入一个边长为10.0Å的TIP3P水分子矩形周期性盒子中。
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模拟设置：所有MD模拟均使用AMBER18软件进行，包括能量最小化（约束和无约束）、两阶段加热、平衡模拟和最终100ns的生产模拟。
Q5：什么是WHALES描述符？在本文中是如何应用的？
A：WHALES（Weighted Holistic Atom Localization and Entity Shape）描述符是一种用于表征分子结构的描述符，它能够以整体的方式编码几何原子间距离、分子形状和原子属性。在本文中，WHALES描述符被用于执行基于NMI-001的骨架跃迁相似性搜索：
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所有化合物（包括 NMI-001）都被WHALES描述符编码。
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通过计算WHALES描述符的欧几里得距离来衡量化合物与NMI-001的相似性。
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保留了与NMI-001距离较近的968个化合物用于后续的筛选步骤。
