Cell Stem Cell | 在单细胞分辨率下探究肠道生态微环境发育图谱

组织中的干细胞微环境是调节干细胞维持自我更新和分化所必需的， 微 环境 由物理和化学线索组成，包括细胞外基质、细胞间接触、生长因子和其它小分子，如代谢产物。了解各种组织中的 微 环境 对于理解组织如何维持内稳态以及疾病如何发生至关重要。最近，单细胞技术的应用挖掘出大量关于健康和疾病期间人类肠道组织的细胞异质性和肠道干细胞（intestinal stem cell, ISC） 微 环境 的信息，这为我们提供了大量关于细胞类型和在各种情况下调控ISCs 微 环境 线索的信息。

鉴于对人类胎儿肠内间充质细胞异质性知之甚少，所以为了更好地了解发育中的人ISC 微 环境 的间充质细胞群，研究人员从绒毛形态出现后（受孕后47天）开始采集人类胎儿十二指肠或邻近十二指肠的近端小肠样本，并进行组织学和分子分析。随后为了捕获对人类肠道发育有贡献的全部细胞类型，研究人员在受孕后47至132天的8个样本中分离出全厚度的肠道组织，使用scRNA-seq对24,783个细胞进行分析，通过计算提取了间充质细胞并对其进行了重新聚集，注释了一组 PDGFRA ^HI 细胞群，以及 ACTA2 ⁺ / TAGLN ⁺ 平滑肌细胞。

在发育中的人类肠道中，目前还没有研究使用过高分辨率技术（如scRNA-seq）来探究 微 环境 因子。为了确定假定的 微 环境 因子，研究人员首先确定了人类肠道中哪些细胞表达了已知的 微 环境 因子，并且发现EGF作为小鼠肠道培养增殖的关键驱动力，在间充质细胞群中未观察到表达，而EGF家族成员NRG1在 F3 ^HI / PDGFRA ^HI 细胞群中富集，NRG1是 F3 ^HI / PDGFRA ^HI 细胞群中表达最强的EGF家族成员之一。考虑到EGF对于体外肠样培养的重要性，进一步通过scRNA-seq和FISH探究了EGF和EGF受体是否在发育中的肠上皮中表达。结果表明包括EGFR、ERBB2和ERBB3在内的ERBB受体在整个上皮细胞中广泛表达，而ERBB4没有表达。虽然EGF在肠间质中不表达，但观察到EGF在分化的上皮 FABP2 ^HI 肠上皮细胞的一小部分中表达。此外，NRG1在靠近隐窝的 F3 ^HI / PDGFRA ^HI SECs中表达。

为了探讨NRG1和EGF对肠上皮细胞的影响，研究人员将在标准生长条件下培养的人类胎儿十二指肠上皮细胞分成两组，一组加入EGF，另一组加入NRG1。在用IF和FISH分析后，观察到EGF培养物中有 OLFM4+ 和 OLFM4- ，同时MKI67染色显示该组肠样物质高度增殖，而NRG1处理的肠道中 OLFM4 均匀表达。通过对两组进行了scRNA-seq，观察到两组之间的基因表达存在差异。研究表明EGF在已建立的肠样培养物中相对于NRG1能促进增殖，NRG1培养中的一些细胞可能处于分化的早期阶段，不支持在已建立的肠样培养物中增殖和生长。

为了进一步了解在EGF、NRG1和EGF/NRG1中生长的肠样细胞的细胞异质性，研究人员使用人类胎儿上皮细胞作为高维搜索空间，以确定肠样及其体内对应体之间的潜在对应关系。并使用超过100天（101-132天）的4个样本定义了人类胎儿肠道中的主要上皮细胞群和9种上皮细胞类型。随后研究者将在EGF、EGF/NRG1或NRG1中生长的肠样细胞映射到体内上皮细胞上，观察发现NRG1处理的肠样细胞映射到所有细胞类型，包括杯状细胞（第4簇）、CHGA+EECS（第8簇）、簇状细胞（第7簇）和BEST4+肠细胞（第5簇），这些细胞类型在EGF或EGF/ NRG1生长的肠样细胞中都不存在。以上结果表明NRG1培养的肠样细胞相对于EGF培养的肠样细胞分化能力增强。

图5. 实验示意图。来源: Cell Stem Cell

参考文献

1. Kim, JE., Fei, L., Yin, WC. et al. Single cell and genetic analyses reveal conserved populations and signaling mechanisms of gastrointestinal stromal niches. Nat Commun 11, 334 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-019-14058-5

2.Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nat Rev Mol Cell Biol 22, 39–53 (2021). https://doi.org/10.1038/s41580-020-0278-0