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Nature | 上田泰己团队揭示磷酸化和去磷酸化酶群调控哺乳动物的睡眠与觉醒

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-11-07 08:33

正文

我们每天都在睡眠与觉醒的交替中度过。睡眠是所有具有神经系统的动物都保留的、对生命至关重要的生理现象。尤其在现代24小时社会中，如何确保健康的睡眠习惯已逐渐被广泛关注。包括人类在内的动物每天都需要一定量的睡眠，未能达成这一需求会让我们感到“睡眠不足”。然而，目前仍然存在许多未知之处，尚不清楚每日睡眠量究竟是如何被分子机制所控制的。

近年来，多个研究结果显示，在调节睡眠与觉醒方面，神经中的蛋白质磷酸化这一化学修饰起到了关键作用。细胞内的磷酸化通过蛋白激酶和磷酸酶的双向调控。例如，东京大学医学院功能生物学专业的上田泰己教授团队之前发现，一种称为CaMKII（钙/钙调蛋白依赖性激酶II）的蛋白激酶具有促进小鼠睡眠的活性。然而，抑制睡眠（即促进觉醒）的蛋白激酶以及调控睡眠-觉醒的磷酸酶在哺乳动物中的作用尚不明确，调控睡眠-觉醒周期的蛋白质磷酸化修饰的整体机制仍未被完全揭示。

因此，该研究团队将注意力集中在可能促进哺乳动物觉醒的蛋白激酶PKA上。已知PKA在果蝇中具有促进觉醒的作用，且在哺乳动物中，PKA的激活会导致非快速眼动（NREM）睡眠的碎片化及NREM睡眠期间脑电图Delta波功率（作为睡眠压力或睡意的指标）增加。然而，PKA对每日睡眠时间的具体影响仍不清楚。此外，关于磷酸酶的研究显示，钙调神经磷酸酶在果蝇中可能具有促进睡眠的效果，但在哺乳动物中，磷酸酶的作用尚未被充分理解。

2024年11月6日，上田泰己教授（兼任理化学研究所生命功能科学研究中心合成生物学研究团队的团队负责人以及久留米大学特聘教授）团队（共同一作为博士研究生王乙萌和曹思钰，讲师大出晃士参与）在Nature上发表了文章Postsynaptic competition between calcineurin and PKA regulates mammalian sleep-wake cycles，通过构建基因敲除小鼠以及利用病毒载体进行功能改造酶的表达实验，发现激活PKA会降低睡眠时间和睡眠压力（睡意）指标，而激活PP1和钙调神经磷酸酶则会增加睡眠时间和睡意指标。PKA、PP1和钙调神经磷酸酶在突触（负责神经细胞间信息传递的结构）中发挥重要作用，且睡眠与觉醒的促进活动相互竞争，从而调节每天的睡眠时间。该研究揭示了多种酶协同调控睡眠和觉醒平衡的机制，为从分子水平探索控制睡眠时间和睡意的方法提供了重要见解。

为了研究PKA在哺乳动物睡眠调控中的作用，该研究团队构建了敲除PKA各亚基基因的小鼠模型，并分析了其睡眠表型。结果显示，当敲除抑制PKA磷酸化酶活性的调节亚基Prkar2b基因时，小鼠的非快速眼动（NREM）睡眠时间减少，Delta波功率降低。由于Prkar2b基因的功能是抑制PKA的磷酸化活性，因此敲除该基因可能会导致PKA活性增加。这一结果表明，PKA的激活可能会降低睡眠压力，从而促进觉醒。

为了验证这一点，研究团队利用病毒载体，在小鼠脑中全域表达了抑制PKA酶活性的多肽以及具有恒定激活状态的PKA催化亚基组成性活性突变型。结果发现，表达PKA抑制肽的小鼠显示出NREM睡眠时间和Delta波功率的增加；相反，表达组成性活性PKA突变体的小鼠则表现出NREM睡眠时间和Delta波功率的减少。这些结果证实了PKA的激活会导致睡眠时间和睡眠压力的减少。

已有研究表明，PKA在兴奋性突触后致密区发挥作用，并参与调节突触可塑性。因此，研究团队将恒活化型PKA亚基与兴奋性突触后致密区的定位信号结合，并在小鼠中表达，结果同样观察到睡眠时间和睡眠压力的减少。这表明，PKA可能在兴奋性突触后致密区促进觉醒。

接下来，研究团队对调控睡眠和觉醒的磷酸酶进行了探索。哺乳动物的大脑中主要活跃着PP1、PP2A（蛋白磷酸酶2A）和钙调神经磷酸酶这三种去磷酸化酶。团队敲除了组成这些磷酸酶的相关基因，并对小鼠模型进行分析。结果显示，敲除调控PP1在兴奋性突触后致密区定位的调节亚基Ppp1r9b基因的小鼠，表现出NREM睡眠时间和Delta波功率的减少。这一现象可能是由于PP1无法定位至兴奋性突触后致密区引起的。

为验证这一现象，研究团队使用病毒载体在小鼠中表达了组成性活性PP1突变体。当该突变体以与兴奋性突触后致密区的支架蛋白融合的形式表达时，观察到NREM睡眠时间延长。这种融合蛋白的构建使其更易定位至兴奋性突触后致密区，因此结果表明PP1在促进睡眠方面需要定位至兴奋性突触后致密区。

关于钙调神经磷酸酶，虽然果蝇研究已显示其在睡眠调控中的作用，但在哺乳动物中，由于钙调神经磷酸酶基因敲除会导致胚胎致死，因此难以进行睡眠表型的分析。研究团队通过病毒载体诱导钙调神经磷酸酶的后天性敲除，结果发现敲除该酶的小鼠表现出NREM睡眠和Delta波功率的减少。此外，在经历断眠后，该小鼠在NREM睡眠时并未表现出正常情况下应有的Delta波功率增加。这表明钙调神经磷酸酶在NREM睡眠的促进和睡眠压力的增加中具有重要作用。进一步实验显示，恒活化型钙调神经磷酸酶仅在附加了兴奋性突触后致密区定位信号时，才能使NREM睡眠和Delta波功率增加。

以上结果表明，PKA作为磷酸化酶促进觉醒，而PP1和钙调神经磷酸酶作为磷酸酶促进睡眠，这些酶均在兴奋性突触后致密区调控睡眠和觉醒。进一步的研究表明，PKA与PP1或钙调神经磷酸酶在调控睡眠时间时相互竞争。当组成性活性PKA突变体与PP1或钙调神经磷酸酶的突变体共表达时，PP1或钙调神经磷酸酶的睡眠促进作用能够抵消PKA的觉醒促进作用。这证实了PP1和钙调神经磷酸酶在兴奋性突触后致密区与PKA竞争，共同调节睡眠时间（下图）。

总之，本研究表明，果蝇中PKA的觉醒促进作用和钙调神经磷酸酶（Calcineurin）的睡眠促进作用在哺乳动物中同样存在。同时，研究还表明PP1与钙调神经磷酸酶类似，具有睡眠促进活性。特别是通过这次使用哺乳动物的研究，发现这些酶均参与睡眠压力的调控，且在兴奋性突触后致密区的蛋白激酶和磷酸酶之间存在功能性竞争。这种调控模式可能对哺乳动物的睡眠时间和睡眠压力的动态调整至关重要。

该研究要点包括：