我叫林平之，是莫愁师姐的师弟，万年NPC。这几天在做qPCR，好烦，老是会出来这样的曲线。各位请上眼：
这是为啥呢？我不明白啊，看着扩增挺好的啊！
莫愁：是因为你……用了全自动的基线范围设置的吧……
qPCR的扩增曲线是这样的，分成：基线期，指数增长期，线性增长期和平台期：
基线期最为重要，但是由于每管中荧光值不同，就会导致起始荧光可能不太一样，原始的扩增曲线可能是这样的：
所以，你看到的扩增曲线，都是经过均一化的。所谓的均一化，就是把所有的基线期都调整到一起。也就是将基线都默认成为1，这样就能看出均一化后的扩增是如何来了。但是，如果是这样的话，如何定义基线期，就是个问题了。基线范围是同步设置的，也就是不管你有几条曲线，都要按照这个范围来设置基线范围，那我们如果基线范围设置得宽了的话，就会变成：
这种情况就说明，你已经把指数增长期设置到基线范围内了。原因就是扩增起来得太早，默认的基线范围一般是1-13个循环，那遇到扩增在10个循环就起来的话，我们只要手动把基线范围调整至1-5个循环就行了：
要知道，基线范围设置得越好，扩增效率也会不同，比如：
基线范围设置到1-15个循环后，标准曲线的斜率，很有可能会大于-3.10，而不是在-3.58～-3.10这个范围之间（扩增效率为90%～110%）。
说到标准曲线，你还可能会遇到这种情况：
高浓度的样本扩增后，扩增曲线很难看，但稀释后就变好看了。为啥呢？因为高浓度样本可能会自带一些扩增抑制的因素在里面，稀释后抑制解除了，就自然变好了。这种情况下，要酌情调整初始浓度和稀释倍数。
当然，你还会遇到过这种曲线：
这种曲线一般会在ABI或者罗氏的机器上遇到，为啥？因为这两个牌子的机器，都需要加入ROX这样的内参，内参加多了，就会导致这样的曲线了。蓝儿，Bio-Rad用的是Led灯，所以一般没这种问题……
对了，你可能还遇到过这种曲线：
回复“扩增曲线”就告诉你，为啥会产生这样的曲线……
李莫愁博士：
qPCR是实验室应该来说最常用的技术了，但多多少少也会出现这样那样的问题，ABI和罗氏的软件都不是特别亲民，不是我瞎吐槽：界面冷冰冰，还有一堆不知道怎么设置的参数，说明书都几十页，一般人都只会按照全自动设置来操作，于是就会出现一系列的问题。还需要大家自己去开动脑筋哦！好了，今天就先策到这里吧。
