果子荐读
不一会的功夫，春卷的CRISPR/cas9基因编辑推文第一部分已经完成，她用5篇帖子完成了从零开始到选择有效sgRNA的全部过程。
接下来就是真正的开始。
在文末，她还有一段真诚的总结。
我们公众号目前有三个实验专栏，分别是高师姐，豆子还有春卷，当我们在写作的时候，并不是居高临下地要求大家跟着做，而是提供新的思路，开拓眼界。
一个研究生，只要做过一段时间实验，就会慢慢形成自己的心得体会，甚至最终变成自己的护城河。极端的师兄甚至会告诉自己的师弟师妹，细胞吹打，108下，不能多也不能少，要不然细胞就养不好。
我们的三个专栏就是来击穿这个迷信的。
高师姐并没有跟豆子学习WB，你甚至可以看到面对同样一个实验，他们的心得完全不一样，但是，不妨碍他们自己都在发10分的paper
他们各自的体系是自洽的，跟着任何一位都可以完全掌握科研技能。
而那些心得不过是手熟后的自然而然的产物，在这之前他们哪一个不是投入了大量的时间呢。
我们有很多小伙伴，总是犹豫自己是否该学一门新的语言，比如编程，有R，有Python，有Perl，有Juli，
选择起来很困难，
假如你听了我的话
如果临床医生只学一门语言，那就是R语言。
那么还会面临很多问题，我该学习R语言基础，还是直接从tidyverse开始，画图是用base plot打好基础还是直接起手就是ggplot2？
焦虑年年有，选择的时候特别多。
但，所有的这些焦虑都会在你写完1000行代码后荡然无存。
当用shell完成了dplyr的操作后，所有买过的linux书突然变成了立体的，我知道了取舍；
当用Python完成了一次data wrangling后，我发现我手上90%的Python资料都可以扔掉，为什么之前不觉得呢。
当完成了一次爬虫，html，css，JavaScript，代理池，代理cookie，这些看起来无比高深的知识也能接受了。
这就是我今年感受最深的地方，
当你想要学习一项新技能的时候，趁着心是热的，那怕只有三分钟，你赶紧去学，要不然一会就要改变主意的。
而改变主意最糟糕的地方在于，你并没有死心，当下次被某个讲座再次燃起热情的时候，你又开始了无休无止的资料收集工作，收集完成后仿佛有了世界，然而却从不开始真正的学习。
以下是正文：
大家都知道CRISPR-Cas9有脱靶效应，并且每个sgRNA的效率都不一样的，因此在做正式实验之前，我们要验证sgRNA的效率，之后优中选优。还是那句话，同样的目的有很多不同的方案，我了解到的有：
-
使用sgRNA靶点筛选试剂盒，优点快速、工作量小且可以大批量进行；
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将sgRNA-pSpCas9转入293细胞中，提取293细胞基因组DNA，PCR扩增目的DNA片段后，使用T7核酸内切酶，验证sgRNA切割效率；
欢迎大家补充，互相交流，提供更方便快捷的方案，由于我们实验室购买试剂盒时间长，相对困难，且sgRNA的切割效率的验证还是活细胞内效率最为准确。经过课题组师兄DZ的优化，一般我们针对一个基因的简单敲除，设计2个sgRNA即可，并且选择方案2进行验证。
接前期推文，我们做了一手漂亮的质粒转染后，
如何确定sgRNA切割活性，这条sgRNA到底还要不要，就看今天了
。
实验正文
1. 实验准备
2. 实验步骤
（1）293细胞转染
在转染前一天，将293细胞以单细胞分散状态种至6孔板中，组别设计为：
293未转染组（negative control），293转染组
。转染当天293细胞融合度为30~40%，将2.0~2.5 μg pSpCas9_sgRNA质粒使用lipofectamine 3000按照常规条件转染（具体细节请参照上期文章），72 h内进行下一步实验。
注意事项：由于293细胞贴壁不牢，很容易被吹落，因此在滴加转染试剂的时候要十分轻柔，换液时要更加小心沿壁加入，并且培养基要提前预温。
（2）提取293细胞基因组DNA
这里我们使用的是天根公司的基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒要求即可。
实验细节调整：
原protocol可能需要消化细胞后再加裂解液，在这里由于293细胞非常容易脱落，因此我选择不消化细胞，弃去上清，直接使用孔种的培养基吹落细胞，移入1.5 ml EP管离心去除上清后，直接加入裂解液吹打，之后步骤同试剂盒要求一样。
（3）使用高保真DNA聚合酶完成PCR实验
一定要使用高保真酶的原因是，T7 EI内切酶的原理是识别突变位点，所以如果使用的DNA聚合酶不够保真，在PCR过程扩增错误，引入突变，则会影响后续结果。
在这里需要提醒的是，任何DNA聚合酶的使用，一定要严格查阅相应说明书，确定实验条件
。我们使用的是NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，根据说明书指示，Q5 DNA聚合酶做的PCR实验，其primer的退火温度和普通我们使用的不一样，需要使用NEB公司的Tm calculator工具计算得出。
（4）胶回收PCR扩增出的目的序列
胶回收的原则就是，量大质优，严格按照说明书操作即可。
（5）T7 Endonuclease I 酶切实验
配置实验反应
按照以下条件annealing
设置酶切反应后，37 ℃孵育15分钟
（6）琼脂糖凝胶电泳，预测分子量大小<1 kb，使用 1.5~2%琼脂糖；分子量大小为1~10 kb大小时，选用1-1.2%
（7）结果分析示例
对于左图
（1）可以看到negative control组中，T7酶并没有将DNA切断，可以说明没有出现基因错配的情况；
（2）而分别用了sgRNA 1 和sgRNA 2的两组，均出现了DNA被切割的现象，且切割后的片段长度加起来，恰好等于uncut line。
以上结果说明，在未转染sgRNA-Cas9组（NC）中，DNA保持了原有的正确序列，转染sgRNA-Cas9质粒后的细胞，基因已经被编辑。sgRNA 1和2均可切割，且量条sgRNA的效率差不多，随手选一条即可。
右图是更加标准的做法，左图少了blank control 组（不加T7 酶的组）
。
我是小结
CRISPR-Cas9基因编辑的直接敲除系列，今天写到这里算是完成了预实验部分。这个时候可以把整个方案的流程放在这里权当总结，并提示之后实验方向方向：
准备工作和预实验要至少得到以下简化的实验结果：
作者心声
在结尾我想分享一下自己的小小感想：首先感谢果子老师给我这个机会，发布我的系列实验文章，平时写的实验记录和经验分享，受众都是我自己，因此无论好坏，有无含糊，都没有那么在意。当初果子老师跟我提这事儿的时候我犹豫了，因为我们每个人都要对自己的言论和行为负责，一旦放到公众号上，这就说明我要对自己写过的东西负责，应尽自己最大努力去保证我所发布的内容没有误导读者，同时也要保证自己写的不浪费读者的时间，要有干货不掺水。因为有这样的原则在，写教程最大的受益者是我自己，因为我写得有多细，就代表我学得有多少，读者不一定会复刻我的所有实验，但我却能复盘我的每一次实验思路，读者的评论或建议，这我打开自己新思路的机会，所以也要感谢大家。最后，再次感谢我的师兄DZ，是他不厌其烦的解答我的问题，无保留的传授我实验方案，感恩。
下周三见~
