识别相分离结构仍然具有挑战性
新出现的研究表明冷凝物(在某些情况下是LLPS)在人类健康和疾病中起着至关重要的作用。相分离的多分子组装体为细胞内划分生化反应提供了一般的调节机制。虽然研究很少，但相分离可以为潜在的治疗干预提供新的途径。相分离的靶向治疗可以极大地扩展转录因子和其他蛋白质的药物开发策略，而这些蛋白质是出了名的难以药物化的。然而，哪些蛋白在肿瘤细胞中经历LLPS，从而在肿瘤生长和转移中起决定性作用，目前尚未确定。
靶向FOXM1凝析物可减少乳腺肿瘤的生长和转移
在这项研究中，
苏州大学
周芳芳教授
团队、浙江大学
张龙课题组
、
杨兵课题组
、
毛峥伟课题组
筛选了乳腺肿瘤细胞中的相分离蛋白，并确定叉头(FKH)盒蛋白M1 (FOXM1)是最突出的候选蛋白。致癌FOXM1与FKH共识DNA元件进行液-液相位分离(LLPS)，并将细胞核中的转录装置区隔化，从而维持了染色质可及性和对肿瘤转移产物至关重要的超增强子结构。筛选表观遗传学化合物文库，作者确定AMPK激动剂是FOXM1缩合的抑制因子。AMPK在内在无序区(IDR)磷酸化FOXM1，扰乱凝聚物，减少致癌转录，积累双链DNA以刺激先天免疫反应，并赋予离散FOXM1激活免疫原性相关基因表达的能力。
通过开发遗传密码扩展正交系统，作者证明了IDR1特定位点的磷酸化片段引起静电排斥，从而消除FOXM1的LLPS和聚集。一种靶向IDR1并携带AMPK磷酸化残基的肽被设计用于破坏FOXM1 LLPS，并被证明可以抑制肿瘤恶性，挽救肿瘤免疫原性并改善肿瘤免疫治疗。总之，这些发现为FOXM1的功能和机制提供了新颖而深入的见解，并开发了具有临床应用前景的方法。相关工作以“
Targeting FOXM1 condensates reduces breast tumour growth and metastasis
”为题发表在
Nature
。苏州大学
副教授谢枫
为论文第一作者兼共同通讯作者，浙大城市学院医学院曾玲晖教授博士后
周晓雪
为本文共同第一作者。
【文章要点】
一、FOXM1经历IDR1依赖性LLPS
作者通过筛选实验发现，FOXM1是肿瘤细胞中形成蛋白质凝聚体的关键成分之一。体外实验表明，FOXM1全长蛋白可自发形成微米级液滴，这种相分离行为依赖于FOXM1中间区域(IDR1)的存在，单独的IDR1区域也能形成液滴。在细胞内，内源性FOXM1也以核内凝聚体的形式存在，并能发生融合和扩散，这些过程可被热、蛋白酶K或5% 1，6-己二醇破坏。FOXM1的IDR1区域不仅调控LLPS，还参与FOXM1的自聚集和纤维化聚合，这些特性可能增强FOXM1的转录活性。通过光遗传学实验，人工诱导IDR1区域聚集也能促进FOXM1在细胞内形成液滴样结构。总之，这项研究揭示了FOXM1参与LLPS的分子机制，为理解FOXM1在肿瘤发生发展中的重要调控作用提供了见解。
图1 FOXM1经历IDR1依赖性LLPS
二、AMPK磷酸化FOXM1并破坏LLPS
作者进一步探讨了调控FOXM1 LLPS的关键机制， 发现AMPK激活剂如metformin、2-DG和AICAR能够抑制FOXM1的核内凝聚体形成和转录活性。机制上，AMPK的催化亚基AMPKα2与FOXM1直接结合，并能磷酸化FOXM1的S376位点。这种磷酸化修饰破坏了FOXM1的LLPS行为。体外实验表明，AMPK复合物可直接磷酸化FOXM1的S376位点，从而减弱FOXM1与DNA的结合和相分离能力。人工引入S376磷酸化也可模拟该效应。在细胞系中，AMPK激活剂诱导的FOXM1 S376磷酸化，同样抑制了FOXM1的凝聚体形成、蛋白聚集和转录活性。FOXM1 S376磷酸化可能通过引起分子间的静电排斥，从而破坏FOXM1自身的相互作用和相分离过程。总之，这项研究揭示了AMPK通过磷酸化FOXM1的关键S376位点来调控FOXM1的液-液相分离状态，从而抑制其转录活性的机制。
图2 AMPK磷酸化FOXM1并破坏LLPS
三、S376磷酸化唤醒免疫原性
ATAC-seq和CUT&Tag分析表明，FOXM1 S376E磷酸化突变体细胞中，FOXM1结合于基因启动子区域以及全基因组的染色质可及性均显著降低。通过CUT&Tag检测H3K27ac修饰(活跃增强子标记)发现，S376E细胞中与超级增强子相关的基因表达下调，而这些基因通常是FOXM1调控的肿瘤相关基因。转录组分析结果也验证了S376E细胞中肿瘤相关通路和分子事件下调，但免疫原性相关基因上调。研究机制发现，S376E细胞中存在大量细胞质游离DNA，可激活cGAS-STING信号通路，诱导干扰素应答和DNA损伤信号。综合FOXM1结合位点和表达谱的分析，S376E细胞FOXM1从肿瘤相关基因转向免疫原性基因的调控，降低了肿瘤迁移侵袭能力，但提高了对免疫细胞介导杀伤的敏感性。总之，这项研究揭示了FOXM1 S376磷酸化状态的转换，使其从驱动肿瘤进展转变为激活肿瘤免疫原性的功能调节。
图3 S376磷酸化唤醒免疫原性
四、S376磷酸化的FIP4降低FOXM1 LLPS
通过结构预测和分子对接，作者设计了三种能结合FOXM1 IDR1区域的肽序列FIP，其中FIP4融合了磷酸化的S376位点。体外实验表明，FIP4比FIP3更有效地阻断FOXM1的自聚集和相分离行为，这是因为FIP4的磷酸化修饰引起了FOXM1分子间的静电排斥。在细胞水平，FIP4也显著抑制了内源性FOXM1的核内凝聚和蛋白聚集，从而减弱了其转录活性和肿瘤恶性表型。转录组分析发现，FIP4处理后细胞中肿瘤相关基因表达下调，但免疫原性基因上调，与FOXM1 S376磷酸化的作用一致。在裸鼠移植瘤和MMTV-PyMT转基因乳腺肿瘤模型中，FIP4处理显著抑制了原发瘤的生长和肺部转移。综上所述，这项研究通过设计靶向FOXM1相分离的小分子抑制剂FIP4，证实了FOXM1的相分离调控在肿瘤发展中的关键作用。
图4 S376磷酸化的FIP4降低FOXM1 LLPS
五、FIP4的递送改善了肿瘤免疫治疗
作者通过开发pH敏感、cRGD修饰的纳米载体来靶向递送FOXM1抑制剂FIP4的策略，并验证了其在体内抑制肿瘤生长和转移的疗效。作者制备了直径90-110nm的pH敏感型纳米颗粒FIP4-NPs，在中性pH下药物释放缓慢，而在弱酸性条件下可快速释放FIP4。体内荧光成像实验显示，修饰cRGD靶向肿瘤的FIP4-NPs在肿瘤部位可大量积累，明显高于自由FIP4或无靶向的FIP4-NPs。转录组分析证实，FIP4-NPs处理的肿瘤细胞表现出类似S376E和FIP4处理的基因表达特征，即抑制恶性表型、增强免疫原性。体内实验评估显示，FIP4-NPs对大鼠主要器官无明显毒副作用，且能够抑制原发肿瘤生长和肺部转移。作者将FIP4-NPs与PD1/PD-L1免疫检查点抑制剂联合使用，能够进一步增强抗肿瘤免疫应答和抑制肺转移。综上所述，这项研究开发了有效靶向FOXM1 LLPS的纳米载体FIP4-NPs，显示了其在抑制肿瘤进展和增强免疫治疗疗效方面的应用前景。
