秋天的第一杯“奶茶”，从超绝分析思路开始：南方医科大学“NETs+单细胞+机器学习”豪取1区11+！5图易复现，换个疾病照样行

嘿，这里是馆长，今天一看日历，居然立秋已过，各位宝子们有没有收到秋天的第一杯奶茶呢（比奶茶更重要的是，希望天气如节气名字一样秋天到来），没有收到也没有关系，馆长送你一个超绝的分析思路~

单细胞测序 作为科研界的“当红炸子鸡”咱们也是有所耳闻的，而 机器学习 作为发文神器更是斩“文”无数，聪明的宝子们肯定猜到了，馆长今天带来的文章便是 单细胞测序+机器学习 。南方医科大学南方医院房付春团队使用单细胞测序发现NETs相关的基因，并基于此利用机器学习进行预测模型构建，最终五张主图一举拿下11.4分一区TOP！生信分析方面还是比较常规的，下面一起跟随馆长的脚步来学习吧！

1、多组学数据整合与机器学习的应用 ：结合了单细胞测序和批量转录组测序数据（ 转录组四处碰壁？不妨尝试加入单细胞数据 ），并使用WGCNA来识别共表达基因模块，此外采用 6 种机器学习算法构建牙周炎预测模型，并通过交叉验证方法提高了模型的稳定性和泛化能力。

2、细胞间通讯分析与实验验证 ：运用CellChat和NicheNet软件包探索了细胞间的配体-受体交互作用，通过体外实验验证了特定中性粒细胞亚群与NETs形成的关系，最后使用实时定量PCR对scRNA-seq数据中的关键基因表达进行了验证（ 干湿结合，更受到审稿人青睐 ）。

ps：机器学习或单细胞数据分析都需要良好的数据分析平台，普通的笔记本或台式都跑不动了，如不愿求诸于人，馆长

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题目 ：人牙龈单细胞图谱揭示了NETs相关的调节牙周免疫的嗜中性粒细胞亚群

杂志 ：Journal of Advanced Research

影响因子 ：IF= 11.4

发表时间 ：2024年0 7 月 30日

研究背景

中性粒细胞是口腔屏障组织中最丰富的先天免疫细胞，对维持牙周免疫稳态至关重要。然而，中性粒细胞的过度招募或激活会导致牙周微生物群与宿主免疫反应之间的失衡，最终可能引发牙周炎。尽管在某些基因突变相关的患者中，中性粒细胞的缺乏或功能缺陷与严重牙周炎的早期发展有关，但中性粒细胞如何促进牙周病的病理过程尚不完全清楚。

研究思路

研究者通过单细胞RNA测序技术深入分析了牙周组织中中性粒细胞的异质性，并首次定义了与中性粒细胞胞外捕获器（NETs）相关的中性粒细胞亚群（NrNeu）。进一步通过体内实验验证了NETs在牙周炎发展中的作用，并利用机器学习技术构建了基于关键NETs相关基因的牙周炎预测模型。此外还探讨了牙龈成纤维细胞通过特定信号轴促进NrNeu亚群形成NETs的分子机制，旨在为牙周炎的临床诊断和治疗提供新的理论和实践依据。下面为研究流程图：

数据来源

主要结果

1. 人牙龈组织的单细胞 图谱

研究者 通过 scRNA-seq 技术对来自3名健康个体和3名确诊为牙周炎患者的牙龈组织样本进行了分析。经过 质量控制 筛选后（ 图 1A），利用 UMAP 技术鉴定出了九种主要的细胞群体（ 图 1B）。通过热图展示了与每种细胞群体相关的标记基因表达水平（ 图 1C）。 随后 比较了牙周炎组与健康组之间各个细胞群体的 表达变化差异 （ 图 1D）。结果显示， 在牙周炎中，基质细胞、上皮细胞和肥大细胞显著减少，而浆细胞、B细胞和中性粒细胞显著增加 。 进一步 通过 免疫荧光染色 确认了人类和小鼠牙周炎牙龈组织中中性粒细胞浸润的增加（ 图 1E）。 （ps：这里直接用免疫荧光染色对 中性粒细胞浸润 情况进行验证，并抓住 中性粒细胞 这一点进行后续的分析 ）

图1 人牙龈组织的单细胞图谱

2. 通过 中性粒细胞异质性分析鉴定 Nets 相关亚群

研究者进一步将中性粒细胞细分为 四个亚群 ：N0、N1、N2和N3。与健康组相比，牙周炎组中N3亚群 显著减少 （ps：图2A右，可以看出N3亚群数量极少），而N0、N1和N2亚群 增多 ，尤其是N0亚群（图2B）。通过 WGCNA 鉴定了与这些亚群相关的基因模块，发现蓝色模块基因在N0亚群中高度表达，且与NETs形成途径 显著相关 （图2F）。 拟时序分析 揭示了从健康状态到牙周炎状态中性粒细胞亚群的变化，其中NrNeu（N0）和ANeu（N2）亚群可能在牙周炎的发展有密切关系（图2H）（ps：这里研究的重点从亚群转移到NETs）。

图2 通过中性粒细胞异质性分析鉴定 NETs 相关亚群

3. NETs促进牙周病的免疫病理学变化

研究者使用 DNase I （ ps：是一种已知的NETs抑制剂 ）对对照组和实验性牙周炎（LIP）小鼠进行了处理（图3A）。通过 免疫荧光分析 发现与健康对照小鼠相比，LIP小鼠的上颌组织中NETs标记物表达显著增加；而在DNase I处理的LIP小鼠组中，与对照组相比，这些标记物的表达明显减少， 表明NETs被抑制 （图3B）。

HE染色 显示，在抑制NETs后，LIP小鼠的牙龈组织炎症细胞浸润和附着丧失减少（图3C）。此外，DNase I处理显著降低了LIP小鼠牙龈炎症因子的表达（图3D），表明 NETs能够调节局部炎症反应 。 Micro-CT 分析表明，抑制NETs减轻了LIP小鼠的牙槽骨吸收（图3E和F）（ ps：通过这两种实验，成功验证了NETs的功能 ）。

图3 NETs促进牙周病的免疫病理学变化

4. 基于NETs相关的基因（NrGs）构建牙周炎的预测模型

研究者首先通过联合分析在牙周炎中NrGs的差异表达基因以及GSE16134数据集中确定的牙周炎相关基因，然后通过 Lasso回归 和 多因素逻辑回归 ，最终筛选出三个关键基因（图4B和C）（ps：抓住NETs这一点，于是找到其相关基因，并着重开始构建预测模型）。随后采用 六种机器学习算法 构建了牙周炎预测模型。在模型构建过程中，使用了 k折交叉验证 （k=5）来增强模型的稳定性。 内部验证 和 外部验证 结果表明 模型具有很好的泛化能力 （图4D,E,G）。此外，通过scRNA-seq数据和临床牙龈样本验证了这三种关键基因在牙周炎中的上调表达（图4H和4I）。（ps：通过外部数据集进行验证，增加模型可信度）

图4 基于NETs相关的基因构建牙周炎的预测模型

5. 牙周炎牙龈成纤维细胞通过MIF-CD74/CXCR4增强NrNeu形成 Nets

研究者通过 细胞间通讯分析