突破基因融合检测“金标准”，新技术应当具备这些能力

大家好，我是恒特基因的首席技术官和联合创始人陈力。今天我主要会谈分子病理检测。大家知道，一般来说一个新技术 出现的时候，用什么判断它是否可靠？是把这个技术和被认为已有最 可靠的技术进行比较，这个已有最可靠的技术被称之为金标准。做基 因融合的金标准是什么呢？在二代测序出来之前被认为是 FISH（荧光 原位杂交），因此基因融合的分子病理检测结果需要和 FISH 金标准进 行对比，如果结果吻合，那么证明结果是可靠的，如果不吻合，也不 能说这个技术比金标准更好，因为金标准被假设为就是准确的。

如何证明新方法比金标准更优？首先金标准判读为正确的，新技 术的检测也必须正确。第二，在金标准无法检验的情况下，新技术还 有可能检验出来。也就是说，新技术的检测结果要和金标准的结果吻 合，还必须做得更好。

下 面给大家介绍一篇文章，《Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing》,发表在《Nature Medicine》上，从学术上来说这是一篇很老的文章，研究从 2011 年就开始，2014 年发表。 这篇文章介绍了一种用二代测序检测基因融合的方法。

这里介绍恒特基因的首席科学家郑宗立博士，他是我在哈佛医学 院麻省总医院的同事，这篇文章是他的代表作品。文章的通讯作者 John Iafrate 教授是麻省总医院分子病理科的主任，也是 FDA FISH 检 测 ALK 基因融合指南的编写者。

Iafrate 教授还开发过一个 PCR 方法用于检测点突变，和 FISH 一 起在分子病理实验室里使用，AMP 发明半年后他就决定把这个方法 替换掉，使用 AMP 方法进行肿瘤基因的分子病理检测。AMP 技术已 于 2013 年由麻省总医院向美国专利局提交专利申请，2016 年 11 月 拿到了授权。该专利的所有人是麻省总医院，独家授权给了 Archer DX 公司使用，这家公司是恒特的合作伙伴。

接下来比较 FISH 和 AMP 各自的特点。FISH 通过荧光颜色变化来 人工判断是否发生了基因融合，但是对融合断点的分辨率差，还有一 个缺点是人工判读容易出错，培养一个能够准确判读片子的病理学家 非常耗时间。

AMP技术把各种基因的组合做成一个Panel，检测多个基因，对感兴趣的基因进行靶向测序，发现未知基因序列和癌基因的融合，在分子水平上获得确凿证据，并且用算法来客观判读。

文章中比较了四个基因：ALK、ROS1、RET、PPARG的融合现象。与标准的检测方法FISH相比较，AMP显示出其在临床灵敏度和特异性方面的优越性能。针对23个目标基因的检测，56例FISH阳性的FFPE样本，AMP均为阳性，临床灵敏度为100% (95% CI：96.5%-100% ) 。273例FISH阴性样本，结果均为阴性，临床灵敏度为100% (95% CI：99.3%-100% )。AMP对FISH不确定的案例也做出了准确判读。此外，AMP的检测成功率97%，由986份临床样本实测数据统计出来的。

这说明，第一 AMP 和 FISH 结果吻合。第二 AMP 在一些情况下比FISH表现更好更准确。

AMP 对新型基因融合的发现能力非常强。 刚发现 ALK 基因融合时，人群中的突变比例大约是 1%。现今 ALK 融合占了 4%到 5%，所以新型基因融合类型的发现不只是学术上，对 病人、医生以及药企来说意义也非常明显。

AMP对新型基因融合的发现能力非常强，在这篇文章中发现ROS1有很多新型的融合断点，包括和其他一些基因的重排。这些在临床病理上的意义是非常显著的。

我们知道ALK基因刚开始被发现有融合的时候，当时发现人群中的突变比例大约是略超过1%。所以，当初开发针对ALK靶向药克唑替尼的时候就比较犹豫。现今ALK重排占到了4%到5%之间，比当初发现的时候高出了很多，对病人、医生以及药物研发企业来说是非常有利的现象，所以新型基因融合的发现不要简单认为只是学术上的内容，对临床和经济及社会方面的作用也非常明显。

这 张幻灯片是 ASCO2107 上发表的 关于新药 LOXO － 101 与 NTRK 基因融合突变的内容，进一步证明了发现新型基因融合的意义。关于 LOXO－101 的临床试验对 NTRK1/2/3 三个基因进行了 “篮子试验”，不是根据病理或临床分期，只要是 NTRK  融合阳性就 可以进入药物试验，采用分子检验入组，这和传统的病理入组就颠倒过来了。

AMP可以对其它多种突变类型进行检测，包括点突变、插入／缺失、拷贝数，以及表达不平衡。AMP使用了单分子标签（MI）技术降低检测过程中的误差。单分子标签近来谈得很多，其实在多年前就成熟地运用了。不使用MI技术，低于3%－5%的突变频率检测结果就不可靠。

Archer DX是一家总部位于科罗拉多的公司，也是恒特基因的战略合作伙伴。产品使用定装干粉试剂，操作非常简便，按部就班，不容易出错。Archer DX有几大类产品，FUSIONPlex以RNA为模版检测基因融合和表达不平衡，VARIANTPlex检测DNA拷贝数变异和点突变、插入缺失。还有Immunoverse免疫组库，以及Reveal ctDNA液体活检产品。

研发人员的原动力在于开发新技术。恒特正在开发的PANO-SeqTM主要是为了解决两方面的问题。首先是比一般的扩增法更均一，提高困难位点的覆盖程度。第二是高灵敏度和特异性，满足液体活检需求。

PANO-SeqTM有许多优势，一方面是模块化设计。临床病理样本多种多样，有可能是组织切片、石蜡切片、穿刺样本，也有可能是全血或者血浆。所以产品用了模块化的方法，根据不同的样本类型搭配不同的模块。第二，是全能型设计，在一个反应管中可同时处理DNA和RNA模版，检测DNA拷贝数、点突变、插入和缺失、RNA表达不平衡和融合，精简了操作时间和工作量。

一个完善的检测方法除了要有实验流程，还需要有生物信息学支持。恒特开发了一整套的分析程序，在测序完成数个小时之后可以得到检测结果。

总而言之，恒特新开发的技术期待在不远的未来再次挑战基因融合检测金标准。