编者按:本文根据恒特基因首席技术官陈力博士在贝壳社上海沙龙上 的演讲整理,原题为《AMP 锚定多重扩增技术对基因融合的检测》, 内容有删改。以下为正文:
大家好,我是恒特基因的首席技术官和联合创始人陈力。今天我主要会谈分子病理检测。大家知道,一般来说一个新技术 出现的时候,用什么判断它是否可靠?是把这个技术和被认为已有最 可靠的技术进行比较,这个已有最可靠的技术被称之为金标准。做基 因融合的金标准是什么呢?在二代测序出来之前被认为是 FISH(荧光 原位杂交),因此基因融合的分子病理检测结果需要和 FISH 金标准进 行对比,如果结果吻合,那么证明结果是可靠的,如果不吻合,也不 能说这个技术比金标准更好,因为金标准被假设为就是准确的。
如何证明新方法比金标准更优?首先金标准判读为正确的,新技 术的检测也必须正确。第二,在金标准无法检验的情况下,新技术还 有可能检验出来。也就是说,新技术的检测结果要和金标准的结果吻 合,还必须做得更好。

下面给大家介绍一篇文章,《Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing》,发表在《Nature Medicine》上,从学术上来说这是一篇很老的文章,研究从 2011 年就开始,2014 年发表。 这篇文章介绍了一种用二代测序检测基因融合的方法。
这里介绍恒特基因的首席科学家郑宗立博士,他是我在哈佛医学 院麻省总医院的同事,这篇文章是他的代表作品。文章的通讯作者 John Iafrate 教授是麻省总医院分子病理科的主任,也是 FDA FISH 检 测 ALK 基因融合指南的编写者。
Iafrate 教授还开发过一个 PCR 方法用于检测点突变,和 FISH 一 起在分子病理实验室里使用,AMP 发明半年后他就决定把这个方法 替换掉,使用 AMP 方法进行肿瘤基因的分子病理检测。AMP 技术已 于 2013 年由麻省总医院向美国专利局提交专利申请,2016 年 11 月 拿到了授权。该专利的所有人是麻省总医院,独家授权给了 Archer DX 公司使用,这家公司是恒特的合作伙伴。
接下来比较 FISH 和 AMP 各自的特点。FISH 通过荧光颜色变化来 人工判断是否发生了基因融合,但是对融合断点的分辨率差,还有一 个缺点是人工判读容易出错,培养一个能够准确判读片子的病理学家 非常耗时间。
AMP技术把各种基因的组合做成一个Panel,检测多个基因,对感兴趣的基因进行靶向测序,发现未知基因序列和癌基因的融合,在分子水平上获得确凿证据,并且用算法来客观判读。
文章中比较了四个基因:ALK、ROS1、RET、PPARG的融合现象。与标准的检测方法FISH相比较,AMP显示出其在临床灵敏度和特异性方面的优越性能。针对23个目标基因的检测,56例FISH阳性的FFPE样本,AMP均为阳性,临床灵敏度为100% (95% CI:96.5%-100% ) 。273例FISH阴性样本,结果均为阴性,临床灵敏度为100% (95% CI:99.3%-100% )。AMP对FISH不确定的案例也做出了准确判读。此外,AMP的检测成功率97%,由986份临床样本实测数据统计出来的。
这说明,第一 AMP 和 FISH 结果吻合。第二 AMP 在一些情况下比FISH表现更好更准确。
AMP 对新型基因融合的发现能力非常强。刚发现 ALK 基因融合时,人群中的突变比例大约是 1%。现今 ALK 融合占了 4%到 5%,所以新型基因融合类型的发现不只是学术上,对 病人、医生以及药企来说意义也非常明显。
AMP对新型基因融合的发现能力非常强,在这篇文章中发现ROS1有很多新型的融合断点,包括和其他一些基因的重排。这些在临床病理上的意义是非常显著的。
我们知道ALK基因刚开始被发现有融合的时候,当时发现人群中的突变比例大约是略超过1%。所以,当初开发针对ALK靶向药克唑替尼的时候就比较犹豫。现今ALK重排占到了4%到5%之间,比当初发现的时候高出了很多,对病人、医生以及药物研发企业来说是非常有利的现象,所以新型基因融合的发现不要简单认为只是学术上的内容,对临床和经济及社会方面的作用也非常明显。

这张幻灯片是 ASCO2107 上发表的 关于新药 LOXO - 101 与 NTRK 基因融合突变的内容,进一步证明了发现新型基因融合的意义。关于 LOXO-101 的临床试验对 NTRK1/2/3 三个基因进行了 “篮子试验”,不是根据病理或临床分期,只要是 NTRK 融合阳性就 可以进入药物试验,采用分子检验入组,这和传统的病理入组就颠倒过来了。

AMP可以对其它多种突变类型进行检测,包括点突变、插入/缺失、拷贝数,以及表达不平衡。AMP使用了单分子标签(MI)技术降低检测过程中的误差。单分子标签近来谈得很多,其实在多年前就成熟地运用了。不使用MI技术,低于3%-5%的突变频率检测结果就不可靠。

Archer DX是一家总部位于科罗拉多的公司,也是恒特基因的战略合作伙伴。产品使用定装干粉试剂,操作非常简便,按部就班,不容易出错。Archer DX有几大类产品,FUSIONPlex以RNA为模版检测基因融合和表达不平衡,VARIANTPlex检测DNA拷贝数变异和点突变、插入缺失。还有Immunoverse免疫组库,以及Reveal ctDNA液体活检产品。
研发人员的原动力在于开发新技术。恒特正在开发的PANO-SeqTM主要是为了解决两方面的问题。首先是比一般的扩增法更均一,提高困难位点的覆盖程度。第二是高灵敏度和特异性,满足液体活检需求。
PANO-SeqTM有许多优势,一方面是模块化设计。临床病理样本多种多样,有可能是组织切片、石蜡切片、穿刺样本,也有可能是全血或者血浆。所以产品用了模块化的方法,根据不同的样本类型搭配不同的模块。第二,是全能型设计,在一个反应管中可同时处理DNA和RNA模版,检测DNA拷贝数、点突变、插入和缺失、RNA表达不平衡和融合,精简了操作时间和工作量。
一个完善的检测方法除了要有实验流程,还需要有生物信息学支持。恒特开发了一整套的分析程序,在测序完成数个小时之后可以得到检测结果。
总而言之,恒特新开发的技术期待在不远的未来再次挑战基因融合检测金标准。