近日，金匙医学联合河南省人民医院等单位在微生物学领域权威期刊《Microbiology
Spectrum》（IF=9.043）上发表合作研究论文“Genomic
Epidemiology and Characterization of Carbapenem-Resistant Klebsiella
pneumoniae in ICU Inpatients in Henan Province, China: a Multicenter
Cross-Sectional Study”。
河南省人民医院呼吸与重症医学科程剑剑教授，金匙医学研发副总裁李立锋为共同通讯作者；河南省人民医院检验科王山梅教授，金匙医学王磊为共同第一作者。
这项河南地区、多中心、横断面研究于2021年3月10日在河南省内78家医院重症监护病房（ICU）进行，以了解河南省重症监护病房（ICU）患者耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant Klebsiella
pneumoniae，CRKP）的流行情况及分子特征。总共收集了327个CRKP分离株，对189个CRKP分离株进行全基因组测序并对菌株基因组流行病学及特征进行了分析。结果如下：
1. 分子分型结果显示克隆群CG258中以ST11序列型为主，其次为ST2237和ST15序列型，另外使用核心基因组多位点序列分型（cgMLST）可将该群体进一步划分为13个亚型；
2. K-抗原和O-抗原分型结果显示K64(48.1%，n=91)和O2a(49.2%，n=93)是最常见抗原型；
3. 对同一患者的呼吸道和肠道中收集的分离株进行来源分析，发现呼吸道定植与肠道菌群有关(OR=
10.80,P< 0.0001)；
4. 绝大部分（95.2%）分离株为多重耐药（MDR），一半以上（
59.8%）的菌株为广泛耐药（XDR）；
5. 采用一种正则化回归模型，对需氧菌素（aerobactin）和沙门菌素（salmochelin）序列类型进行分析，可预测肺炎克雷伯菌株高黏液表型。
在这项研究中，我们分析讨论了CRKP的流行情况，通过基因组学和统计分析揭示了河南省医院ICU感染患者的CRKP的基因组学特征，这提示具有多重耐药和高毒力的CRKP对临床的威胁日益严重。
肺炎克雷伯菌（Klebsiella
pneumoniae）是一种常见的机会致病菌，可导致严重感染，包括肺炎、脑膜炎、坏死性筋膜炎、眼内炎、肝脓肿和血流感染等。而耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant Klebsiella
pneumoniae，CRKP）的分离数量的不断增加也引起了临床的广泛关注。根据2022年中国耐药监测网统计数据表明，河南省是肺炎克雷伯菌发病率最高的省份，且对碳青霉烯类抗生素的耐药率高达32.8%。CRKP在医院内感染和暴发很常见，其中重症监护病房（ICU）中呼吸机和静脉导管的使用是肺炎克雷伯菌医院感染的常见危险因素。本研究旨在利用全基因组测序、多位点序列分型和核心基因组多位点序列分型对河南地区的ICU患者中分离到的CRKP进行流行病学和基因组学特征研究。
1. 分离株的收集及表型鉴定。
在河南省78家医院采集2021年3月10日的所有ICU住院患者的呼吸道和肠道样本（包括咽拭子、鼻咽拭子、痰液、直肠拭子），并通过药敏实验及肺炎克雷伯菌的分离培养得到CRKP分离株。
2. 全基因组测序、组装和注释。
在Illumina平台上对分离株进行测序，并使用fastp对原始数据进行质控、SPAdes对基因组进行组装。得到基因组装数据后分别利用Prokka、ResFinder、VFDB进行基因组注释、抗生素耐药基因和毒力基因的鉴定。
3. 泛基因组分析及序列分型。
使用PEPPAN、BacWGSTdb、SeqSphere1分别对CRKP进行泛基因组分析、MLST和cgMLST的鉴定，并利用单链层次聚类得到核心基因组序列类型(CgSTs)。
4. 全基因组比对、变异检测、种群结构和系统发育树分析。
5. 统计分析。
①利用Pearson相关系数用来评估遗传特征与抗菌素耐药性之间的关系的强度和方向。②采用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney-Wilcoxon检验比较SNV数和AMR基因数的差异。③采用结合了LASSO和岭回归的Logistic回归进行变量选择，检验相关遗传特征对表型的综合影响。
1. CRKP分离株及其基因组特征。
从河南省78家参与医院的1058名ICU患者中分离得到
327株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，
ICU患者中
CRKP分离率为20.9%
（n=228）。菌株的基因组平均大小为5.770Mbp，所有CRKP的泛基因组包含3,569个核心基因。
2. 分子流行病学分析。
①本次收集的CPKP中ST11型最为常见，占比为88.9%（n=168），其次为ST2237型，占比为5%，另外还鉴定出一个未被报道的新序列型ST587。②在cgMLST分析中发现了13个集群，其中ST11以cgST1、cgST10和cgST7为主。③根据基因座序列预测，共鉴定出9种荚膜类型（K抗原），最常见的是K64(48.1%，n=91)、K47(22.2%，n=42)、K25(12.7%，n=24)和K19(8.5%，n=16)。
3. 系统发育关系的重建。
根据核心基因的等位基因差异重建了分离株的系统发育。ST11分离株形成了非常紧密相关的谱系，可分为两个分支，而属于其他序列类型的分离株则与之具有更大的遗传距离。在全省不同地区CRKP分离株的流行率和多样性存在较大差异。CRKP在西北城市的流行率和多样性较高。具体来说，CRKP在焦作最为常见，而在郑州多样性最强，可能与郑州拥有多家中心医院，是省内其他医院转院的首选目的地之一有关。
4. 多位点定植。
在59名患者的呼吸道和肠道中同时获得CRKP分离株，其中44名患者中的呼吸道和肠道分离菌株属于相同的支系。经分析，呼吸道CRKP定植可能与肠道CRKP携带与有关（OR=
10.80,P< 0.0001）。
5. 抗生素耐药性。
经过MIC实验，大多数菌株对阿米卡星（84.7%，n=160）和左氧氟沙星（98.9%，n=187）耐药，而对头孢他啶-阿维巴坦（94.7%，n=179）和多粘菌素（97.9%，n=185）敏感。大多数菌株（95.2%，n=180）表现出多重耐药（MDR）；一半以上菌株（59.8%，n=113）显示广泛耐药（XDR）。
6. 高黏液表型。
分离菌株中高黏液表型率为19.6%（n=37），并且该表型与ST11型、ST421型和ST65型显著相关（P<0.0001）。研究表明，沙门氏菌素（salmochelin）、需氧菌素（aerobactin）相关基因以及rmpA2、fimB、 manC、senB、tle1等基因为高黏液表型的预测因子。此外，在一家医院发现了具有超强毒力的ST11-K65-O2a
CRKP菌株暴发事件。
在这项多中心横断面研究中，我们通过全面的大规模监测获得了更为全面的河南省医院ICU患者中CRKP流行率和多样性数据。在序列分型方面，研究结果进一步印证了ST11-KL64和ST11-KL47是中国CRKP的主要类型。同时，ST2237型的频率升高以及新序列型ST587的出现，也表明需要提高对疾病控制的重视以及持续监测的重要性。在肺炎克雷伯菌感染来源方面，研究结果表明大多数患者的呼吸道和肠道的肺炎克雷伯菌分离株为同一来源，该结果进一步支持了肠道菌群可作为呼吸道感染病原来源的理论。在耐药方面，研究结果表明，95.2%的CRKP分离株为多重耐药，59.8%的CRKP分离株广泛耐药，这与blaKPC-2(98.9%)和ESBLs(75.7%)的高携带率一致。
总之，本研究通过对河南地区ICU患者中CRKP的基因组流行病学及特征进行了全面系统的分析，为临床医生和相关研究人员的后续研究提供了重要的参考依据。
目前，
金匙医学的耐药表型预测产品GenseqAMR
3.0已可预测近百种细菌-抗生素模型
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7种常见耐药细菌及1种复合群，35种临床常用抗生素，
在宏基因组检出病原的同时，为临床医生尽可能的提供最全面可靠的用药参考，助力精准治疗。该产品可检测内容如下：
针对本研究的189例CRKP菌株样本，使用GenseqAMR
3.0流程进行药敏预测分析，结果显示7个药物预测结果与临床培养药敏的一致性均高于90%，其中美罗培南、亚胺培南、左氧氟沙星和粘菌素的一致性高于97%；
进一步针对河南省地区，基于金匙医学收集到的呼吸道标本，我们统计了近半年GenseqAMR3.0产品预测肺炎克雷伯菌（检出reads≥2000条）各药物药敏结果的报告比例。显示，碳青霉烯类药物耐药率为32%，头孢菌素类药物耐药率在31-39%之间，喹诺酮类药物耐药率为27%，氨基糖苷类药物耐药率在20-31%之间，头孢他啶/阿维巴坦的耐药率较低（低于3%）。其中碳青霉烯类药物的耐药率与2022年中国细菌耐药监测网的数据（32.8%）相近。
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