1664年秋，牛顿开始研究微积分问题。当时，他反复阅读笛卡儿《几何学》，对笛卡儿求切线的“圆法”产生了浓厚的兴趣，并试图寻找更好的方法。就在此时，牛顿首创了小o记号，用它表示x的增量，它是一个趋于零的无穷小量。牛顿在家乡躲避瘟疫期间，继续探讨微积分并取得了突破性进展。据他自述，1665年11月发明“正流数术”（微分法），次年5月又建立了“反流数术”（积分法）。1666年10月，牛顿将前两年的研究成果整理成一篇总结性论文，现在称为《流数简论》。当时虽未正式发表，但在同事中传阅。《流数简论》是历史上第一篇系统的微积分文献。《流数简论》反映了牛顿微积分的运动学背景。该文事实上以速度形式引进了“流数”（即微商）的概念，虽然没有使用“流数”这一基本术语，但在其中提出了微积分的基本问题，用现在的数学语言可以表述如下：
牛顿指出，第一个问题是微分的问题，第二个问题的第一个问题的逆运算，并给出了相应的计算方法。在此基础上，建立了的“微积分基本定理”，它揭示了“导数和积分之间的内在联系”。当然，对微积分基本定理，并没有给出现代意义下的严格证明。在后来的著作中，对微积分基本定理，牛顿又给出了不依赖于运动学的较为清楚的证明。
在牛顿以前，面积总是被看成是无限小不可分量之和，牛顿则从确定面积变化率入手，通过反微分计算面积。这样，牛顿不仅揭示了面积计算与求切线问题的互逆关系，并且十分明确地把它作为一般规律揭示出来，从而建立了微积分普遍算法的基础。正如牛顿本人在《流数简论》中所说：一旦反微分问题可解，许多问题都将迎刃而解。自古希腊以来，人们得到了许多求解无限小问题的各种特殊技巧，牛顿将这些特殊技巧统一为两类普遍的算法——正、反流数术，即微分与积分，并证明了二者的互逆关系，进而，他将这两类运算统一成一个整体——微积分基本定理。这是他超越前人的功绩，正是在这样的意义下，我们说牛顿发明了微积分。在《流数简论》的其余部分，牛顿讨论了求曲线切线、曲率、拐点，求曲线长度、求曲线围成的面积，求引力与引力中心等16类问题。对这些问题的讨论，牛顿都是运用他建立的统一的算法来处理的，所有这些充分显示了牛顿创建的“微积分”算法的极大普遍性与系统性。从1667年起到1693年牛顿用了大约四分之一世纪的时间，从事微积分方面研究。牛顿始终不渝努力改进、完善自己的微积分学说，先后写成了三篇微积分论文：（1）1669年完成了《运用无限多项方程的分析》，简称《分析学》；
（2）1671年完成了《流数法与无穷级数》，简称《流数法》；
（3）1691年完成了《曲线求积术》，简称《求积术》。
牛顿对于发表自己的科学著作态度谨慎，他的大多数著作都是经朋友再三催促才拿出来发表。上述三篇论文发表都很晚，其中最先发表的是最后一篇《曲线求积术》；《分析学》发表于1771年；而《流数法》则迟至1736年才正式发表，当时牛顿已去世。
1687年，牛顿出版了他的力学名著《自然哲学的数学原理》，简称《原理》，在《原理》中，最早表述牛顿创立的微积分学说，因此，《原理》也成为数学史上的划时代著作。《原理》被爱因斯坦盛赞为“无比辉煌的演绎成就”。全书从三条基本的力学定律出发，运用微积分工具，严格地推导证明了包括开普勒行星运动三大定律、万有引力定律等在内的一系列结论，并且还将微积分应用于流体运动、声、光、潮汐、彗星乃至宇宙体系，充分显示了这一数学工具的威力。牛顿的科学贡献是多方面的。在数学上，除了微积分，他的代数名著《普遍算术》，包含了方程论的许多成果，如虚数根成对出现、笛卡儿符号法则的推广、根与系数的幂和公式等等；他的几何杰作《三次曲线枚举》，首创对三次曲线的分类研究，这是解析几何发展一个新的高峰；在数值分析领域，今天任何一本教程都不能不提牛顿的名字。
