为了方便大家理解,小编特意找出了“前言”中出现的专业名词,并做了相关解释,接下来就要直奔主题了。由于文章篇幅较长,小编将把全文分为三大部分进行解读:
(1)铁死亡的调控机制;
(2)铁死亡相关的信号通路;
(3)铁死亡相关的疾病及治疗。
近年来,人们对铁死亡机制的认识突飞猛进。随着胱氨酸/谷氨酸反向转运体-GSH-GPX4通路在抑制铁死亡中的作用被发现,目前磷脂氢过氧化物(PLOOHs,一种基于脂质的ROS形式)被确定为是铁死亡的执行者(图2)。最近又发现了GPX4非依赖性的铁死亡监控通路。此外,在铁死亡背景下,PLOOH的合成机制,特别是PUFAs(多不饱和脂肪酸,PLOOHs的前体物质)的合成与活化也已被广泛研究。重要的是,所有这些研究最终都集中在细胞代谢上,揭示出铁死亡和代谢途径之间存在密切联系。
(A) 在经典的铁死亡调控通路中,胱氨酸通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体(system Xc-)进入细胞,接着在谷胱甘肽(GSH)或硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)依赖的胱氨酸还原途径中还原生成半胱氨酸,促进GSH生成。GSH是一种强效的还原剂,可作为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的辅因子,在细胞内促进磷脂氢过氧化物(PLOOHs)还原为PLOOHs相应的醇(PLOHs)。谷胱甘肽-二硫化物还原酶(GSR)利用NADPH/H+提供的电子催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)重新生成GSH。(B) 两项独立进行的基因筛查研究中,发现FSP1(铁死亡抑制蛋白1)/泛醌(CoQ10)系统完全可以保护细胞免受由药物抑制Gpx4或Gpx4基因敲除引起的铁死亡。与GPX4/GSH不同,FSP1通过降低脂基水平上的泛醌/α-生育酚来防止脂质过氧化和与之相关的铁死亡。(C) 其他铁死亡抑制机制,包括鲨烯介导的和二/四氢生物喋呤(BH2/BH4)介导的对脂质过氧化的抑制,尽管这一过程的化学机制仍有待研究。
经典的GPX4调控铁死亡机制(Cyst(e)ine/GSH/GPX4轴)
为了寻找新型抗癌小分子,Stockwell团队从2001年开始进行了高通量筛选,并在2003年发现了一系列复合物,这些复合物能够诱导细胞以一种独特的、区别于细胞凋亡和细胞坏死的方式死亡。反向筛选结果表明,多种铁离子螯合剂以及亲脂性自由基捕获型抗氧化剂(RTAs)可以抑制这种类型的细胞死亡。由于铁在这种形式的细胞死亡中不可或缺,因此将这种细胞死亡形式命名为“Ferroptosis”,即铁死亡。随后在对铁死亡机制的研究中确定了两个细胞组分,Xc-系统和GPX4,利用化合物erastin和RSL3分别抑制它们的活性会诱导铁死亡发生。
GPX4是Ursini及其同事通过生化纯化发现的一种硒蛋白,是哺乳动物细胞中催化PLOOHs还原的主要酶。GPX4可将磷脂和胆固醇氢过氧化物还原为相应的醇,这个过程需要GPX4中硒代半胱氨酸残基的催化活性以及主要由GSH提供的两个电子,电子有时也可来自其他小分子硫醇,甚至蛋白质硫醇。Conrad团队曾透彻研究过第一个Gpx4条件敲除小鼠模型,发现Gpx4的缺失会诱导小鼠胚胎成纤维细胞以脂质过氧化物依赖的、非凋亡的形式死亡,并引起小鼠大脑海马区和皮质区内的神经退化。这个和其他几个小鼠模型有助于描绘出更详细的铁死亡在体内相关性的图像,这些将在下文进一步讨论。
因为GPX4是主要的PLOOH中和酶,所以出现了erastin/RSL3诱导的铁死亡机制:这两种化合物都能灭活GPX4,RSL3直接灭活GPX4,而erastin间接灭活GPX4,主要通过抑制胱氨酸进入细胞使胞内半胱氨酸耗竭(半胱氨酸是是一种必不可少的细胞抗氧化剂,也是细胞内GSH的必要组成成分)。最终的结果是,PLOOHs累积,可能导致膜结构发生快速且不可修复的损伤,从而导致细胞死亡(图2A)。从概念上讲,这些发现明铁死亡在机制上与其他已知的细胞死亡方式不同。基于此机制开发的药理学和遗传学工具使铁死亡相关研究成为可能,而且这些工具已经成为研究铁死亡必不可少的工具。
①磷脂过氧化反应
无限制的脂质过氧化是铁死亡的标志。20世纪50年代的早期研究发现,微量元素硒、维生素E和半胱氨酸可以抑制脂质过氧化。脂质过氧化的启动需要从磷脂上的多不饱和脂肪酸酰基(PUFA-PLs)中脱去两个碳碳双键之间的双烯丙基氢原子,形成以碳为中心的自由基,并与分子氧反应生成过氧自由基(图3)。如果不转化为脂质过氧化氢并还原为相应的醇,自由基介导的反应的传播将导致大量次级产物的产生,膜结构完整性被破坏,并最终导致细胞器和细胞膜破裂。因此,高PUFA-PL含量的细胞膜特别容易发生过氧化反应,已经在神经元中得到了证实。与此一致,全基因组单倍体和基于CRISPR/ cas9的筛选发现了两种膜重塑酶,脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4 (ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 (LPCAT3)是导致铁死亡的重要因素。ACSL4在铁死亡中发挥作用是因为它更倾向于催化长链PUFAs(包括花生四烯酸20:4和肾上腺酸22:4)和辅酶A连接。然后,这些产物会被多种LPCAT酶重新酯化为磷脂,从而增加细胞内长链PUFAs在脂质和膜结构中的掺入。ACSL4的基因缺失会导致磷脂中长链PUFA尾向短链单不饱和脂肪酰基(MUFA)尾急剧转变,其方式类似于ACSL435药物抑制处理的野生型细胞。ACSL4缺陷细胞磷脂中的这种急剧转变,使得Gpx4敲除细胞的增殖可以持续数月,这是之前从未观察到的基因拯救。与上述机制类似,据报道,外源性补充MUFAs、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)介导的细胞内MUFA生成,以及由ACSL3依赖的膜MUFAs富集可降低细胞受铁死亡的影响。值得注意的是,在三阴性乳腺癌的一个细胞亚群中,ACSL4的表达水平与它们对于铁死亡诱导剂的敏感性相关,且在耐药的间充质癌细胞和透明细胞性肾癌细胞中观察到了类似的相关性。因此,抑制ACSL4表达或许是细胞对铁死亡脱敏的主要机制,这一过程可能受到不同的信号通路调控。相反,增加ACSL4表达或提高其活性,可能会在多种病理生理条件下促进铁死亡。
毫无疑问,脂质双分子层的不饱和程度是决定细胞对铁死亡敏感性的关键因素,但关于脂质过氧化是如何启动的仍有许多不确定因素和争论。与共轭二烯相邻的双烯丙基碳具有已知的最弱的碳氢键,这些结构的增加会提高脂类的自氧化速率,如含有PUFA的食物在环境氧张力下会腐败。可以想象,细胞自主产生的脂质烷氧自由基或羟基自由基可以启动不依赖于酶促反应的脂质过氧化,而这一过程可由铁作为催化剂的Fenton反应催化(图3)。(稍后详细说明)。
某些脂加氧酶(LOXs)是非血红素铁依赖的双加氧酶,可以直接氧化生物膜的PUFAs,提示LOXs可能介导铁死亡的诱导过程。已有一些结果支持这一可能性,如一些LOX的药理学抑制剂能够抑制铁死亡,敲除12/15-LOX或应用LOX抑制剂黄岑素(baicalein)可以保护小鼠免受缺血性脑损伤和水肿的形成。然而,在Gpx4敲除小鼠中敲除12/15-LOX并不能保护小鼠成纤维细胞免受铁死亡,也不能防止急性缺血性肾损伤或降低其致死率,也不能恢复T细胞特异性Gpx4-/-小鼠中的CD8+ T细胞。然而值得注意的是,LOXs主要与半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡相关,而非GPX4缺失诱导的铁死亡,因此,有必要利用不同的模型进一步剖析LOXs在铁死亡中发挥的作用。这些数据表明,在ALOX15活性缺失后可能有替代机制进行了补偿,某些频繁使用的“LOX特异性”抑制剂可能作为自由基捕获型抗氧化剂(RTA)发挥了非特异性活性。事实上,最近的一项研究证实,最常用的LOX抑制剂具有RTA活性,因此对通常认为的LOX在铁死亡中的重要作用提出了挑战。此外,对人类所有LOX同工酶活性广泛下调未能阻止RSL3诱导的铁死亡,但很大程度上挽救了erastin诱导的铁死亡,这可能是因为erastin处理激活了脂氧合酶。因此,在大多数情况下LOXs可能不是铁死亡的关键驱动因素,但在某些情况下可能有助于铁死亡的启动和发展。Alox15(花生四烯酸-15-脂加氧酶)或者Alox12(花生四烯酸-12-脂加氧酶)的缺失分别在一些神经退行性或者癌症抑制小鼠模型中表现出保护作用。然而,必须强调的是,这些酶在免疫系统中本身发挥着重要的生理作用,通过产生促炎和抗炎分子直接调节(神经)炎症过程和肿瘤微环境,因此,它们的缺失并不一定与铁死亡直接相关。先前的发现也支持这一观点,GPX4通过所谓的“细胞过氧化物”调控制脂加氧酶和环加氧酶的活性,因为这两种二十烷酸代谢酶都需要通过脂质氢过氧化物氧化它们的铁,以捕获分子氧并将其掺入到PUFAs中。值得注意的是,有报道称ALOX12在过氧化物引发的p53依赖性铁死亡中必不可少,而且这种形式的铁死亡相当独特,因为它似乎不需要ACSL4参与;另外,据报道,磷脂酰乙醇胺结合蛋白1 (PEBP1)可与某些LOXs形成复合物,改变其对PUFA-PLs底物的特异性。
除了有争议的LOXs在铁死亡中的作用外,最近的研究表明,广泛表达的细胞色素P450氧化还原酶(POR)在启动脂质过氧化中发挥作用。NADPH作为电子供体从POR接受电子后,下游电子受体如细胞色素P450和CYB5A被还原,进而通过从PUFAs中提取亚甲基氢或还原铁直接或间接触发脂质过氧化反应。
尽管在细菌膜中普遍缺乏PUFAs,铜绿假单胞菌能够表达一种分泌型脂氧合酶(PA-LOX)。这种酶可诱导人红细胞膜脂氧化,也可诱导人支气管上皮细胞铁死亡。因此,囊性纤维化患者表现为磷脂酰乙醇胺中花生四烯酸氧化水平升高,而磷脂酰乙醇胺被报道是在铁死亡的细胞和组织中检测到的主要磷脂形式之一。这种跨生物的铁中毒诱导机制耐人寻味,值得进一步研究,以确定这一机制是否被其他低等生物利用。
很明显,多种代谢反应可以导致细胞产生PLOOHs,越来越多的证据表明,代谢在铁死亡中起着核心作用。Jiang团队试图确定代谢如何影响细胞命运的研究揭示了铁死亡与代谢的复杂关系。他们研究了自噬这种难以捉摸的促进细胞死亡的功能。自噬作为应对各种压力的重要生存机制,是否以及如何促进细胞死亡(即自噬细胞死亡)已经争论了几十年。出乎意料的是,他们发现在氨基酸饥饿(一种触发有效自噬的条件)时,自噬促进了一种快速的非凋亡、非坏死形式的细胞死亡,但仅仅是在细胞处于血清充足的完全培养基的前提下。他们随后发现,这种形式的细胞死亡需要铁载体转铁蛋白和血清中的氨基酸谷氨酰胺,而从细胞培养基中去除胱氨酸则足以触发细胞死亡。因此,这种类型的细胞死亡(即铁死亡)是由半胱氨酸缺乏(类似于erastin)诱导的,并依赖于转铁蛋白。在胱氨酸缺乏的情况下,自噬通过降解铁蛋白(也称为铁自噬)导致细胞内不稳定铁含量上升,从而使细胞对铁死亡敏感,诱导铁死亡(图4)。谷氨酰胺代谢或谷氨酰胺分解对半胱氨酸缺失诱导的铁死亡是必须的,从而将铁死亡与氧化代谢联系起来。谷氨酰胺分解产生α-酮戊二酸盐,能够为线粒体TCA循环(三羧酸循环)提供能量,这表明线粒体的正常代谢功能似乎与铁死亡相关,随后通过多种药理学、细胞学和遗传学分析得到了验证(图4)。值得注意的是,线粒体早前已被证明线粒体已被证明是氧化凋亡(oxytosis)的活跃参与者。
基于这些发现,人们也提出了更多的假设和问题,例如:作为线粒体TCA循环的主要燃料,葡萄糖是否调控铁死亡?的确,葡萄糖饥饿近年来被发现可以抑制铁死亡。然而,从机制上讲,这一现象似乎主要由AMPK所介导,而非通过TCA和线粒体呼吸调节(稍后详述)。相关的问题是,即使是在富含葡萄糖的条件下培养细胞,如果谷氨酰胺仅仅通过维持线粒体呼吸来发挥促进铁死亡的作用,那么谷氨酰胺如何在半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡中起关键作用?因此,有必要对谷氨酰胺分解在铁死亡中的作用进行详细的研究。此外,线粒体代谢是否通过产生特定的脂质前体促进PLOOH合成(TCA循环的中间产物可以促进脂质合成)或通过促进ROS产生(氧化代谢反应的天然副产物)促进铁死亡?已经有研究发现线粒体活性和谷氨酰胺分解对于半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡是至关重要的,但对于抑制GPX4诱导的铁死亡却并非必不可少,这为后一种可能性即线粒体代谢通过促进ROS产生促进铁死亡提供了更多的支持。
除了线粒体外,植物细胞拥有另一个独特的细胞器-叶绿体,可以进行一连串的氧化还原合成代谢反应。由于在植物中已经发现依赖于铁和ROS的铁死亡,一个有趣的推测是,在植物中叶绿体也可能在铁死亡的调节中发挥重要作用。
细胞代谢的基本功能,特别是磷脂过氧化,解释了铁死亡过程为什么依赖铁。首先,参与磷脂过氧化的代谢酶LOXs和POR发挥催化活性需要铁的参与,而铁对于参与细胞活性氧生成的大量代谢酶也是必不可少的。其次,非酶催化的、铁依赖的Fenton链式反应可能对于铁死亡是必要的:PLOOHs在GPX4被抑制时会持续存在更长时间,从而引发Fenton反应,使铁死亡标志物PLOOHs的含量迅速增加(图3)。PLOOHs能够与亚铁离子和铁离子反应,分别产生自由基PLO•和PLOO•• ,这些自由基与PUFA-PLs反应,进一步促进PLOOH的生成。
考虑到铁在细胞生存和死亡中的核心作用,细胞内铁稳态受到精细控制并不奇怪。铁调节蛋白IRP1和IRP2参与了与细胞内铁储存/释放和摄入/排出相关基因的转录后调节。可以想象,许多细胞过程通过改变细胞内的不稳定铁含量而改变细胞对铁死亡的敏感性。如转铁蛋白及其受体通过将铁导入细胞而共同促进铁死亡。相反,促进细胞内铁排出已被证明使细胞对铁死亡具有更强的抵抗力。此外,血红素加氧酶1(HO-1)介导的血红素降解会释放铁,也与铁死亡相关。然而一系列相互矛盾的数据显示HO-1既可促进铁死亡也可抑制铁死亡。
最近,对小鼠模型的体内研究进一步阐明了铁调控在铁死亡中的作用。例如,敲除铁蛋白重链基因可能通过促进铁死亡导致心肌病。有趣的是,在小鼠肝细胞中特异性敲除转铁蛋白导致的表型出人意料:给敲除小鼠喂养富铁饮食增加了肝细胞的铁负荷(肝细胞是体内合成转铁蛋白的主要细胞类型),这导致小鼠更容易出现肝纤维化,亲脂性RTAs80(亲脂性自由基捕获型抗氧化剂)可改善这种情况。这项研究进一步表明转铁蛋白表达缺失后,SLC39A14(一种金属转运蛋白)在肝细胞中代偿性上调,导致铁的过量摄入。
尽管半胱氨酸/胱氨酸-GSH-GPX4轴被认为是哺乳动物中对抗铁死亡的主要系统,全基因组筛查最近发现了GPX4非依赖性的铁死亡监控机制。
Conrad团队和Olzmann团队分别利用基因抑制剂和CRISPR-Cas9筛选技术,鉴定出铁死亡抑制蛋白1 (FSP1)是与硫醇依赖轴不同的第二种铁死亡关键因子(GPX4非依赖性)。FSP1以前被称为AIFM2,因为它与AIFM1(凋亡诱导因子线粒体相关1)同源。AIFM1最初被认为像AIFM2一样促进凋亡,但现在发现AIFM1与线粒体膜间隙蛋白转运及正确折叠相关。此外,实际上FSP1缺乏实质性的促凋亡功能,但可以保护细胞免受GPX4基因缺失或抑制引起的铁死亡。
FSP1被肉豆蔻酰化修饰,并与包括细胞质膜、高尔基氏体和细胞核周结构在内的多种细胞膜结构相联系。突变FSP1的肉豆蔻酰修饰位点会使它丧失抗铁死亡功能。机制上讲,由于FSP1具有NADH:泛醌氧化还原酶活性,FSP1通过还原泛醌(CoQ10)/泛醌的不完全氧化产物半氢醌产生泛醇,这能够直接减少脂质自由基,终止脂质自氧化反应,或者间接的通过促进氧化型α-生育酚自由基(维生素E,一种强大的天然抗氧化剂)再生,这是脂类中最强大的天然断链抗氧化剂(图2B)。这些研究也解决了一个长期存在的谜题,即为什么在一些细胞和组织中存在大量的线粒体外泛醌,而这与泛醌在线粒体电子传递链中的经典功能是不一致的。
利用CRISPR/ cas9筛选技术,GTP环水解酶-1 (GCH1)最近被报道可通过其代谢产物四氢生物蝶呤(BH4)和二氢生物蝶呤(BH2)抵抗铁死亡。BH4被证明可能通过双重机制,即既作为直接RTA(需要通过二氢叶酸还原酶DHFR再生),又参与CoQ10合成,保护含有两个PUFA尾的磷脂免受氧化降解(图2C)。尽管GCH1在保护组织和器官免受铁死亡中的作用仍有待阐明,但已有基因敲除研究表明,GCH1在小鼠体内的缺失会导致小鼠在妊娠中期的心动过缓和胚胎死亡。
③鲨烯积累
除了直接调控脂双层中的过氧化物或通过一些天然的自由基捕获型抗氧化剂调节磷脂自由基外,细胞也可能通过一些其他的内在机制保护自身免受有害的脂质过氧化。关于这点,胆固醇途径中的一种代谢物鲨烯,已被报道其积累会在固醇缺陷型淋巴癌细胞系和原发肿瘤中具有抗铁死亡活性,尽管尚未证明这是癌症亚型特异性效应还是一种普遍的保护机制(图2C)。
不难想象,凡是能够调控铁死亡的生物学过程,如促进或调控这一过程的分子、氧化还原稳态和铁稳态以及细胞代谢,都可能会影响铁死亡。正如预期的那样,氧化应激反应转录因子NRF2可以通过激活多个经典靶基因的表达来缓解铁死亡。此外,越来越多的证据表明,在特定的生物学背景下,多种信号通路可以控制细胞对铁死亡的敏感性。
虽然GPX4和FSP1在抑制铁死亡方面扮演着重要的角色,但在生理和病理条件下,GPX4和FSP1是如何在转录、翻译以及同等重要的翻译后/活性水平上发挥调控作用,我们还知之甚少。目前已知的是,GPX4和FSP1似乎在某种程度上和甲羟戊酸途径相交集:甲羟戊酸途径是蛋白异戊稀化修饰方式之一,可以稳定Trsp(硒代半胱氨酸特异性tRNA),而Trsp是合成包括GPX4在内的硒酶所必需的,另外,甲羟戊酸途径的终产物之一泛醌(CoQ10)是FSP1的主要底物。
GPX4是人体内25种硒蛋白之一,其表达受到严格调控。有研究表明,增加细胞内硒含量可以协同激活转录因子TFAP2c和Sp1来促进神经元中GPX4的表达。然而值得一提的是,和真正的硒反应蛋白P(SELENOP)、GPX1和GPX3不同,GPX4可以被认为是一种在大多数组织和器官中组成性表达的管家蛋白。已报道的其他调控GPX4表达的转录因子包括肠上皮细胞中的CEBP1和C/EBPα和某些癌细胞中的NF-Y。据报道转录后,GRSF1(鸟嘌呤富含序列结合因子1)能够与线粒体型GPX4 mRNA的5’非编码区结合,促进线粒体内GPX4的翻译,从而在精子发育过程中起着重要的作用。然而,以上调控事件与铁死亡的关系尚不明确。
越来越多的证据表明,GPX4的活性和稳定性也受到调控。例如,持续的氧化应激导致GSH耗竭,这使得GPX4中硒代半胱氨酸活性位点的GSH依赖性还原受损,从而导致GPX4通过β切割过程形成无氧还活性的脱氢丙氨酸和GPX4不可逆的功能失活,此外,在亚硒酸和邻近氨基酸之间形成的硒酰胺可以保护酶发生不可逆失活。然而,在缺血-再灌注损伤(IRI)等病理条件下,这些机制是否发挥作用还需要进一步研究。尽管有研究报道称肠道缺血与较低的GPX4活性和含量有关。此外,包括RSL3在内的多个铁死亡诱导剂最终都会通过硒代半胱氨酸活性位点的共价修饰、干扰甲羟戊酸代谢以及铁依赖的氧化应激等机制导致GPX4耗竭。
作为另外一种重要的铁死亡抑制因子,FSP1最初是作为p53应答基因被发现的,因此FSP1还被称为p53应答基因3(p53-responsive gene 3,PRG3)。FSP1是转录因子NRF2、CRBP和PPARα的靶基因。有趣的是,据报道在T淋巴母细胞性淋巴瘤细胞中,长链非编码RNA MEG3(母系表达基因3)上调FSP1的表达,miR-214下调FSP1的表达,而这两种RNA也同时参与肿瘤发展。除了转录调控,几乎没有人知道FSP1的氧化还原酶活性是如何被调控的,以及FSP1的亚细胞定位如何调控其在不同生理、病理过程中的作用。但FSP1能够同时作用于还原性和氧化性底物(如NADH、NADPH、CoQ10和α-生育酚),表明其活性的调控过程较复杂。