王勇研究组在大肠杆菌中实现了(S)-四氢小檗碱的高效从头合成

( S )-四氢小檗碱是一种具备降糖、降脂和抗氧化等多种活性的原小檗碱类化合物，也是合成小檗碱（抗菌药）和诺斯卡品（抗肿瘤药）的关键前体，在药物研发方面具有巨大的潜力。现阶段，( S )-四氢小檗碱可通过植物提取或化学半合成的方式获得。然而，毛茛目植物根茎中( S )-四氢小檗碱的含量低以及化学合成的立体选择性差等因素，限制了其大规模生产。微生物制造在手性化合物的合成方面独具优势，是合成此类高价值产品的重要技术手段。目前，微生物体系中已能高效合成苄基异喹啉生物碱的共同前体( S )-网状番荔枝碱，但是受限于部分膜蛋白的非功能性表达，还未能实现( S )-四氢小檗碱的高效率从头合成。

本研究首先利用CRISPR-Cas9技术构建了一个高产酪氨酸的大肠杆菌底盘SQZB18，摇瓶培养2天后可积累2.11 g/L的酪氨酸（图1）。随后，研究者发现四氢生物喋呤循环途径整合至基因组前后，过表达大鼠和果蝇来源酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, TYH）的菌株中( S )-网状番荔枝碱的合成趋势发生逆转。结合酪胺的结构特征及体内饲喂实验的结果，推测并证实了酪胺对 Rn TYH ^WR 的抑制作用（图2）。研究者后续巧妙地利用 Ec HpaBC-D11将酪胺转化为多巴胺，解除了酪胺的抑制作用，并通过过表达嘌呤核酸磷酸化酶，获得了菌株SQZ227，经两天的摇瓶培养能产生100.13 mg/L的( S )-网状番荔枝碱（图3）。为了克服小檗碱桥酶（Berberine bridge enzyme, BBE）和四氢小檗碱合成酶（Canadine synthase, CAS）功能性表达的难题，研究者将筛选到的蓟罂粟（ Argemone mexicana L .）来源的小檗碱桥酶（ Am BBE1）进行同源建模和分子对接，得到98%转化率的突变体 Am BBE1 ^F398W-I431F ；另外，在优化CAS可溶性表达的基础上，借助蛋白-肽相互作用结构域（SH3）和其配体（SH3-lig），最终从不同CAS来源的组合中筛选到支架结构的tr Cj CAS- At CPR2，体外条件下能将32%的底物转化为小檗碱（图4）。在此基础上，结合改善膜蛋白表达效率的效应因子（RraA）和细胞色素 b5 ，研究者得到了表现最佳的( S )-四氢小檗碱产生菌SQZ266，该菌株在摇瓶培养下的产量达到16.81 mg/L，在反应器发酵条件下产量达到165.74 mg/L（图5），是目前报道微生物从头合成原小檗碱的最高水平。该研究不仅提供了生物碱高效微生物底盘的设计思路，也为生物碱的绿色和可持续生产奠定了基础。

中国科学院分子植物科学卓越创新中心王勇研究组博士研究生张前为论文的第一作者，王勇研究组的博士研究生吴宇函参与了相关工作。该研究得到国家重点研发计划、上海市学术带头人计划、国家自然科学基金、中国科学院先导项目及植物分子遗传国家重点实验室的资助。