今天给各位介绍这一篇近期发表在Theranostics上的文章，该团队利用单细胞测序技术联合空间转录组学，共同探究肺腺癌从癌前病变到侵袭性变化进展中的过程。究竟怎么样，我们一起看看吧！
标题：An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma
期刊：Theranostics（中科院1区 IF：12.4）
PMID: 38418883 DOI: 10.1038/s41586-024-07113-9
一、研究背景
原位肺腺癌(AIS)详细的细胞群和基因变化，以及它与肺腺癌（LUAD）从AIS到微浸润性腺癌 (MIA)及浸润性腺癌(IAC)侵袭性进展相关的细胞空间信息仍然知之甚少，因此，迫切需要测序技术来确定细胞类型特异性动态变化。
二、实验结果
图1. 本研究的研究设计和主要发现。
1、LUAD细胞类型鉴定及侵袭进展过程中的差异表达基因结果
该团队首先收集了AIS、MIA 、IAC各3个样本进行scRNA-seq测序（图1 A），经过质控总共获得了 115,246 个细胞，大致分为C1到C10的10 个细胞谱系，其中6种细胞类型由经典的基因定义，包括上皮细胞、T/NK细胞、B 细胞、骨髓细胞、内皮细胞 、成纤维细胞（图1 B-C）。使用IF来校准细胞的基因标记物的表达(图1D)。为进一步探讨LUAD侵袭过程的机制，研究人员比较了每种细胞类型的基因表达模式，MIA和AIS (M/A)组之间有512个上调和332个下调的DEG，IAC和MIA (I/M)组之间有199个上调和347个下调的 DEG，IAC和AIS (I/A)组之间有393个上调和345个下调DEG。并且，I/A 组中近一半上调的DEG在M/A 组中已经可检测到（图1 E-F）。DEG 的PCA 显示MIA和IAC在转录组水平上非常接近（图1G），这进一步揭示了LUAD 三个不同阶段的丰富细胞类型（图1 H）。
2、上皮细胞的亚群鉴定及LUAD的起源
为了确认启动 LUAD 侵袭的关键癌细胞亚簇，该团队将上皮细胞重新分析聚类为8个亚群，包括肺泡I型、肺泡II型、Clara细胞 、纤毛细胞等4个正常上皮亚群和Clara-like、TM4SF1+、CRABP2+、UBE2C+这4个癌细胞亚群。相对于另外两个癌细胞亚群，TM4SF1+和UBE2C+癌细胞亚群比例在LUAD侵袭过程中不断增加，在IAC中急剧升高，并且从AIS到MIA，UBE2C +亚型的比例变化比TM4SF1+亚型更为显著（图2 C）。IF 和bulk RNA-seq的结果也证实了UBE2C +亚型癌细胞从AIS逐渐稳定地增加到IAC（图2 D-E）。接着该团队通过TCGA-LUAD数据库也验证了UBE2C+癌细胞对LUAD患者预后的影响，发现它可以作为LUAD预后的生物标志物（图2 F）。ssGSEA分析发现，UBE2C+癌细胞主要富集于MYC靶点V1、细胞周期、AKT和TGF-β信号通路等，这类细胞可能通过这些途径促进癌症的发生发展（图2 G）。并且拟时序分析结果表明，UBE2C+癌细胞是分化最差的癌细胞类型和终末细胞类型（图2 H）。
图2. UBE2C+细胞亚群参与LUAD的整个侵袭过程。
3、UBE2C+细胞亚群参与LUAD 的整个侵袭过程
体外实验证明UBE2C通过影响LUAD增殖和侵袭性来介导LUAD的恶性病理生理过程（图3C-D）。此外，体内实验表明敲低UBE2C能显着抑制皮下肿瘤的生长（图3E-G）。这些结果表明UBE2C介导LUAD细胞的增殖和转移。
图3. 高表达UBE2C促进肺腺癌细胞的侵袭和转移。
4、LUAD侵袭中不同TME细胞亚群的研究
接着该团队开始探索不同类型TME细胞在LUAD侵袭过程中的变化，对主要细胞群进行了进一步研究。将T/NK细胞重新聚类为8个亚群、骨髓细胞重新聚类为10个亚群（图4 A）。结果发现，TPSB2 +肥大细胞和FCN1 +单核细胞占比从AIS和MIA到IAC逐渐持续下降，GNLY +NK细胞占比仅从AIS到MIA增加，而FOXP3 +Tregs的丰度从MIA到IAC显着升高（图4B）。通过bulk RNA-seq和IF进一步证实了细胞亚群变化的情况（图4 C-D）。接下来使用GSVA分析细胞亚群变化中涉及的潜在标志信号通路，细胞周期和细胞生长或增殖相关途径，如PI3K/AKT/MTOR信号等在GNLY+NK和Foxp3+NK中高度富集，WNT和干扰素信号等在TPSB2 +肥大细胞和FCN1+单核细胞富集（图4 E-F）。基于以上结果，该团队提出假设：Tregs 增加和单核细胞减少介导肿瘤相关通路的激活可促进早期LUAD侵袭。
图4 免疫细胞浸润在早期LUAD侵袭过程中的作用。
5、TGF-β信号通路在晚期LUAD的侵袭中发挥关键作用
CellChat分析结果揭示LUAD中细胞之间的前十个相互作用途径（图5 A）。在AIS和MIA中没有观察到癌细胞和TME细胞之间通过TGF-β信号传导进行的通讯，但这种相互作用在IAC中显着加强，特别是在NK细胞、肥大细胞和MALT B细胞中（图5 B)。进一步的分析发现，与AIS和MIA相比，癌细胞和TME细胞中TGF-β配体的水平在IAC中广泛上调（图5 C）。同样的，下游靶基因以及TGF-β途径的下游因子p-SMAD2的表达水平在IAC中高度激活（图5 D-E）。这些结果意味着癌细胞和TME细胞之间TGF-β信号传导的通讯和相互作用在IAC中诱导的TGF-β信号传导的无限制激活可能在晚期LUAD的侵袭中发挥关键作用。
图5 TGF-β信号通路在癌症细胞和TME间的对话作用图谱。
6. 癌症区域Tregs的空间分布介导LUAD侵袭
将AIS、MIA、IAC各2个样本进一步进行空间转录组分析。基于HE染色，将样本分为四个不同的组织学区域，包括癌区域、正常上皮区域、基质区域和淋巴区域。并通过marker基因的表达进一步证实了空间划分的准确性。如预期，TM4SF1+癌细胞、GNLY+NK细胞、NKG7+NK和TPSB2+肥大细胞在癌症中共定位，但未发现FOXP3+ Tregs（图6 D）。同样地，两例IAC 对应的空间和细胞数据也清晰地区分为四个区域。其中TM4SF1 + 癌细胞和 UBE2C+癌细胞在癌症区域富集，CAF（Fib-1）和 FOXP3+Tregs与癌细胞亚群共定位。与AIS相比，IAC癌症脉管系统区域呈现出更明显的血管数量和更高表达水平的VEGFs，相反，AIS没有明显的差异（图6 E-G）。这一发现表明血管生成可能对 LUAD 的侵袭过程有促进作用。
图6 TME空间分布对早期LUAD侵袭的影响。
7、ST分析癌边缘区域比癌中心区域更活跃
为了进一步了解scRNA-seq确定的四个癌症亚群的空间分布和生物学意义，该团队将癌症区域重新聚集为亚区。AIS的TD8样本，由中央区(黑色)和外围区域(红色)组成。结果发现，Clar-like癌细胞在外围区域高度富集，中央区域以TM4SF1+癌细胞为主。Wnt/β-Catenin、血管生成通路等致癌信号在外围区域高度。值得注意的是，与TGF-β信号通路相关的基因在中心区域高表达(图7 E）。最后，分析IAC样本表明，中心区域和外围区域都高度富集TM4SF1+癌细胞和UBE2C+癌细胞，特别是区域5，TGF-β信号通路相关的基因在癌区5高表达（图7 C-E）。总之，这些发现表明UBE2C+癌细胞亚群在驱动AIS 到 MIA过程中起着至关重要的作用，癌细胞与TME之间的TGF-β信号相互作用以及调节免疫逃逸的空间变化都与LUAD侵袭性进展有关（图 7 G）。
图7癌细胞的空间异质性。
三、总结
该团队运用单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 联合空间转录组学(ST)技术，发现肺腺癌（LUAD）侵袭过程中的动态变化和连续进展过程中涉及的细胞和空间状态。研究发现，UBE2C+癌细胞亚群在LUAD侵袭过程中不断增加，其空间分布主要集中在浸润性腺癌（IAC）的周边癌区域。此外，对TME细胞类型亚群的分析显示肥大细胞、单核细胞和淋巴内皮细胞不断减少，这些细胞参与了侵袭性LUAD的整个过程。同时，从AIS到MIA过程中的NK细胞和MALT B细胞增加，从MIA到IAC过程中，Treg 细胞和分泌性B细胞有所增加。值得注意的是，对于AIS，癌细胞、NK 细胞和肥大细胞共定位，对于IAC，Tregs 与癌细胞共定位。最后，癌细胞与TME细胞诱导的TGF-β信号通路的通讯和相互作用参与了IAC的侵袭。研究结果揭示了癌细胞和TME亚群的特定细胞信息和空间结构，以及它们之间的细胞相互作用，这将有助于未来在LUAD从AIS到IAC的侵袭过程中早期发现和靶向治疗。更多详情还请大家移步原文，仔细品鉴。
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